[发明专利]用于蛋白纯化的缓冲液体系

说明书

发明领域

本发明涉及使用一系列色谱单元操作从细胞培养液或发酵培养液中纯化重组蛋白的领域。更具体地，本发明涉及不含氯化钠的缓冲液体系，该体系贯穿在蛋白纯化的一系列单元操作中使用，其中，酸碱组分连同第三种钠盐缓冲液组分以设定的比例组合，为稳健的色谱操作提供充分的对pH值和电导率的控制。

背景技术

在生物处理工业中已良好地建立用于回收重组蛋白的正交纯化工艺并且其继续发展以提高产量、清除杂质、降低产品成本、缩短开发时间，扩大规模等。近年来，平台(platform)方法已明显成熟，其中需要最低限度的开发工作的通用模板工艺可用于回收多种亚类的重组蛋白，尤其是单克隆抗体。在这种情况下，用于单克隆抗体和其它蛋白的平台工艺开发的核心理念是识别和执行适用于多类靶分子的常见的普通单元操作，其能产生一个可以快速设计可扩大规模的、稳健的工艺的纯化步骤的框架。由于开发针对色谱顺序和膜/过滤步骤的操作条件，一个重要的考虑因素是慎重选择产生稳健性和工艺性能提高的缓冲液组分。不用系统化的方法，通过传统的实验室规模的试验，缓冲液的选择过程常可产生大量的在单元操作到单元操作中并不一定被整合的并且在大规模生产的实行中可能是麻烦的组分。为了克服这些问题并且限定缓冲液组分的数量，需要一种整合工艺；此处，我们提出了不含氯化钠的双组分缓冲液体系。

发明内容

一方面，本发明涉及通过一系列色谱步骤来纯化蛋白的多组分缓冲液体系，其中色谱模式选自蛋白A色谱(protein A chromatography)、阴离子交换色谱，阳离子交换色谱和混合模式色谱，其中所述色谱模式或者在结合洗脱模式下或者在流通模式下操作，其中所述多组分缓冲液体系包含有机酸、该有机酸的共轭碱的碱金属盐或铵盐以及有机碱，并且其中使用不添加NaCl的缓冲液进行所述色谱模式。

另一方面，本发明涉及通过蛋白A色谱法从受污染的溶液中纯化蛋白的方法，其包括：(a)用含55mM Tris碱和45mM醋酸的pH约为7.5的蛋白A平衡缓冲液平衡固定在固相上的蛋白A；(b)从受污染的溶液中吸附蛋白至固定在固相上的蛋白A；(c)通过用含55mM Tris碱、45mM醋酸和300mM醋酸钠的pH约为7.5的第一蛋白A冲洗缓冲液冲洗固相来去除污染物；以及(d)用含1.8mM醋酸钠和28.2mM醋酸的pH约为3.6的蛋白A洗脱缓冲液来从固相上回收蛋白，其中所有的缓冲液都不添加NaCl。

另一方面，本发明涉及通过流通阴离子交换色谱法从受污染的溶液中纯化蛋白的方法，其包括：(a)用含55mM Tris碱和45mM醋酸的pH约为7.5的阴离子平衡缓冲液平衡阴离子交换基质；(b)向阴离子交换基质上样受污染的溶液并且收集第一流通液；以及(c)向阴离子交换基质使用含55mM Tris碱、45mM醋酸和300mM醋酸钠的阴离子冲洗缓冲液并且收集第二流通液，其中所有的缓冲液都不添加NaCl。

另一方面，本发明涉及通过阳离子交换色谱法从受污染的溶液中纯化蛋白的方法，其包括：(a)用含25mM醋酸钠和12.1mM醋酸的pH约为5.0的阳离子平衡缓冲液平衡阳离子交换基质；(b)从受污染的溶液中吸附蛋白至阳离子交换基质；(c)通过用含25mM醋酸钠和12.1mM醋酸的pH约为5.0的第一阳离子冲洗缓冲液冲洗固相来去除污染物；以及(d)用含175mM醋酸钠和75mM醋酸的pH约为5.0的阳离子洗脱缓冲液来从固相上回收蛋白，其中所有的缓冲液都不添加NaCl。从这个过程中排除氯化钠确保同时控制和避免高浓度的氯化物溶液对不锈钢加工设备的腐蚀影响。

附图说明

图1示出了单克隆抗体(mAb)平台的下游工艺流程图和用于控制色谱工艺的关键的pH和离子强度范围。

图2示出了为最小化对原料和储罐的需求，从浓缩物制备理想的大规模缓冲液的制备图。

图3示出了对于醋酸和Tris碱缓冲液体系的计算和实验的pH值、离子强度以及缓冲能力的曲线。

图4示出了对于柠檬酸和Tris碱缓冲液体系的计算和实验的pH值、离子强度以及缓冲能力的曲线。

图5示出了醋酸和磷酸钠缓冲液体系的计算和实验的pH值、离子强度以及缓冲能力的曲线。

图6示出了柠檬酸和磷酸钠缓冲液体系的计算和实验的pH值、离子强度以及缓冲能力的曲线。

具体实施方式