[发明专利]抑制PIVKA-II测定试剂中非特异性反应的方法

说明书

技术领域

本发明涉及PIVKA-II的免疫测定，PIVKA-II测定试剂，和PIVKA-II测定试剂盒。

背景技术

PIVKA-II是指被归类为凝血酶原的一种蛋白质，其是不具有凝血因子活性的凝血因子II，并且也被称为异常凝血酶原。凝血酶原合成于肝中并且产生过程需要通过依赖维生素K的γ-谷氨酰羧化酶将谷氨酸(Glu)残基转化为γ-羧基谷氨酸(Gla)残基。虽然在正常凝血酶原的N末端附近存在10个Gla残基，但是PIVKA-II的10个残基中的全部或部分未转化为Gla并且仍然是Glu残基。PIVKA-II最初发现于维生素K缺乏或用维生素K拈抗剂治疗的患者的血液中。因为血液浓度的增加与肝细胞瘤有关联，所以最近PIVKA-II作为肝细胞瘤的肿瘤标记物被测量。PIVKA-II是由维生素K缺乏或拮抗剂诱导的蛋白质-II的简写并且也被称为des-γ-羧基凝血酶原(DCP)(参见：Weitz，I.C.和Liebman，H.A.，(1993)Hepatology18，990-997；Suzuki M，Shiraha H，Fujikawa T，Takaoka N，Ueda N，Nakanishi Y，Koike K，Takaki A，Shiratori Y，J Biol Chem，2005Feb25；280(8)，6409-15；A.Nakao，A.Virji，Y. Iwaki，B.Carr，S.Iwatsuki和E.Starzl，Hepatogastroenterology，1991October，38(5)，450-453)。

作为特异性测量样品中PIVKA-II的方法，目前已知的有通过使用HPLC分离凝血酶原和PIVKA-II的方法（Anal Biochem，1984Feb；137(1)，227-9)，利用聚丙烯酰胺凝胶亲和电泳使用乳酸钙分离凝血酶原和PIVKA-II的方法（非专利文献1)，使用与PIVKA-II(DCP)特异性反应的抗体的基于ELISA的方法（非专利文献2)等。

在非专利文献1的方法中，在电泳时使用乳酸钙，并且这是为了在正常凝血酶原和PIVKA-II之间在电泳迁移率方面产生差异(由于存在具有钙结合能力的Gla残基)从而分离两者。

在非专利文献2中，在存在钙离子的情况下仅使用特异性结合PIVKA-II的抗体(C4B6)来测量PIVKA-II。然而，至今仅C4B6抗体被报道为是用于需要钙离子存在下特异性测量PIVKA-II抗PIVKA-II的抗体。因此，在PIVKA-II(DCP)的测量方法中使用与PIVKA-II特异性反应的抗体通常不需要添加钙。

目前用于特异性测量样品中的PIVKA-II的主流方法是通过两步夹心法使用与PIVKA-II(DCP)特异性反应的单克隆抗体和抗凝血酶原多克隆抗体来测量的基于EIA(酶免疫测定)，RIA(放射性免疫测定)，或ELISA(酶联免疫测定)的方法（例如，JP H05-43357(PCT申请的翻译)和JPH09-43237A)。

钙未被用于JP H05-43357(PCT申请的翻译)，JP H09-43237A和国际公布手册WO2010/104815的、基于ELISA的测量方法中，并且通常认为，钙离子不是测量PIVKA-II所必需的。

专利文献1是通过利用载体颗粒的凝集测量PIVKA-II的一个实例。专利文献1的技术的概述如下。首先，将样品加入到载有PIVKA-II特异性抗体的磁颗粒中以使样品中的PIVKA-II与抗体结合。此时，样品中的正常凝血酶原不与磁颗粒结合。通过磁铁捕获磁颗粒并洗涤以除去正常凝血酶原。然后向磁颗粒中加入载有与PIVKA-II和正常凝血酶原两者都反应的抗凝血酶原抗体的荧光标记的颗粒。结果，形成夹心结构，其中磁颗粒和荧光标记的颗粒通过两种抗体结合到PIVKA-II。该夹心结构用磁铁捕获并洗涤以除去游离的荧光标记的颗粒。最后，对该夹心结构进行碱处理以使荧光标记的颗粒从PIVKA-II解离以测量荧光强度。荧光强度与样品中的PIVKA-II浓度成比例。如上所述，专利文献1中描述的方法是具有B/F分离/洗涤的步骤的非均质测量方法，并且采用源自荧光标记的颗粒的荧光强度的测量作为检测原理而不是利用载体颗粒自身的凝集的光学测量作为检测原理。