[发明专利]在细胞环境中于单分子水平上分析蛋白-蛋白相互作用的方法，和测定在细胞溶质中激活的蛋白密度的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种分析蛋白-蛋白相互作用的方法，以及一种测定细胞溶胞产物中活化蛋白浓度的方法，更具体讲，涉及一种分析蛋白-蛋白相互作用的方法，该方法能够在单分子水平上，在实际细胞内环境中分析所述蛋白-蛋白相互作用，并且，通过改变提供用于观察第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用的第一蛋白的细胞类型之后进行比较，还能够比较和证实每一种细胞状态和第一种蛋白的激活水平，以及一种测定细胞溶胞产物中活化蛋白浓度的方法，该方法能够定量比较和测定实验组细胞和对照组细胞中特定活化蛋白的浓度。

背景技术

细胞通过完成多种生物学功能而维持生命现象，如基因表达，细胞生长，细胞周期，代谢作用和通过多样的和复杂的蛋白-蛋白相互作用介导的信号转导等。因此，了解所述细胞内蛋白-蛋白相互作用和功能一直是我们理解生命现象的重要基础，并且，是我们开发新药和治疗疾病的重要组成部分。

一种在体外研究蛋白-蛋白相互作用的典型方法是亲和层析法。

对于蛋白质亲和层析法来说，纯化蛋白是困难的。另外，由于上述蛋白间的相互作用只进行了体外评估，该方法可能产生假阳性结果，因为蛋白在通过层析柱时可能通过静电相互作用而结合，这种结合不是在细胞中相互作用的结果。

就是说，为了实施定量测量，按照常规技术分析蛋白-蛋白相互作用的方法是在蛋白与其他细胞内物质分离的条件下来分析所述相互作用的，包括纯化存在于用于分析所述蛋白-蛋白相互作用的细胞中的每一种蛋白。因此，在其他蛋白等共存的实际细胞内环境中，在单分子水平上分析所述蛋白-蛋白相互作用是受到限制的。

另外，当其他蛋白参与所述相互作用时，按照常规技术研究蛋白-蛋白相互作用的方法，还具有不能在实际细胞内环境条件下评估其他蛋白对特异性蛋白-蛋白相互作用的影响程度之类的缺陷。

另外，在定量比较和测定实验组细胞和对照组细胞中特定活化蛋白的浓度时，还存在一些常规限制。

发明内容

技术问题

因此，本发明的一个目的是提供一种分析蛋白-蛋白相互作用的方法，该方法能够在实际细胞内环境中，在单分子水平上分析蛋白-蛋白之间的相互作用，以及通过改变提供用于观察第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用的第一蛋白的细胞类型之后进行比较，还能够比较和证实每一种细胞状态和第一蛋白的激活水平

另外，本发明的另一个目的是提供一种测定细胞溶胞产物中活化蛋白浓度的方法，该方法能够定量比较和测定实验组细胞和对照组细胞中特定活化蛋白的浓度。

技术方案

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种通过在单分子水平上分析第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用的方法，包括：（a）准备至少两个基片，其中，在每个基片上结合有第一蛋白结合分子，所述第一蛋白结合分子为将要与第一蛋白结合的生物分子；（b）分别在第一基片和第二基片上诱导所述第一蛋白和所述第一蛋白结合分子之间的结合，包括将对照组细胞所包含的第一蛋白提供给所述两个基片中的第一基片，并且将所述实验组细胞所包含的第一蛋白提供给所述两个基片中的第二基片；（c）当所述第一蛋白和所述第一蛋白结合分子分别与所述第一基片和所述第二基片结合时，将包含标记物标记的第二蛋白的细胞的细胞溶胞产物分别提供给所述第一基片和所述第二基片；和（d）在所述细胞溶胞产物分别提供给所述第一基片和所述第二基片后，比较和分析在所述第一基片和所述第二基片上第一蛋白和第二蛋白之间的相互作用。

优选地，在步骤中（b），所述对照组细胞是正常细胞，而所述实验组细胞是肿瘤细胞。

优选地，步骤（d）包括使用能产生近场的光学设备测量由标记与第一蛋白相结合的第二蛋白的标记物所产生的具有特定波长的荧光信号。

优选地，在步骤中（d），所述具有所述特定波长的荧光信号是在预定的时段内累加测量的。

优选地，在步骤中（d），所述具有特定波长的荧光信号是在提供给所述基片的细胞溶胞产物存在的条件下实时测量的。

优选地，步骤（b）包括将所述对照组细胞的细胞溶胞产物提供给所述第一基片，并且将所述实验组细胞的细胞溶胞产物提供给所述第二基片。

优选地，所述方法还包括在所述步骤（c）之前给所述基片提供缓冲液。