[发明专利]用于大肠杆菌中异源蛋白质生产的新的表达和分泌载体系统

说明书

技术领域

本发明涉及革兰氏阴性原核生物中的重组DNA表达/分泌系统，该革兰氏阴性原核生物如大肠杆菌（Escherichia coli），其包括但不限于大肠杆菌BL21DE3（E.coli BL21DE3）和大肠杆菌K12（E.coli K12）。更详细地，本发明涉及将重组蛋白向大肠杆菌（E.coli）的周质间隙的基于信号肽易位的潜能与大肠杆菌的膜缺陷型突变体相结合以进一步辅助分泌至细胞外间隙（extracellular space）的系统。

背景技术

原核生物已经被广泛地用于生产重组蛋白。受控表达所需多肽或蛋白伴随着通过重组DNA技术将编码蛋白的基因结合在启动子之后，可以通过外部因素调控其活性。在载体上，最通常在质粒上携带该表达构建体。将携带该表达构建体的质粒引入宿主细菌中并在存在激活启动子的化合物的情况下培养该生物体获得高水平表达的所需蛋白。以这种方式，可以生产大量的所需蛋白。

大肠杆菌是用于蛋白质生产的最常用的原核生物。已经开发了许多不同种类的质粒载体用于在大肠杆菌中使用以构建表达系统。不同的变异体采用了几种不同类型的启动子、可选择性标志物和复制起点，其中每种不同的配置赋予表达载体独特的性质。在最常见的布置中，所表达的蛋白质在细胞质中积累。尽管该方法对一些蛋白质是有用的，但是并非所有蛋白质均可以在细胞质中以活性状态积累。通常，当所需蛋白以相对于宿主蛋白高水平产生时，蛋白质以不溶性颗粒（也称为包含体）积累。以包涵体积累的蛋白质难以恢复成活性形式。

解决该问题的两种方式是亦或将目标蛋白输出到内膜和外膜之间的周质中亦或促进向细胞外间隙分泌。使克隆的基因产物分泌到周质间隙/胞外培养基中存在几种可能的优势，包括：1）蛋白质产物可以避开胞质蛋白酶；2）如果被分泌，通常分泌的蛋白质如激素、木质素降解酶和葡聚糖酶可能仅能够在大肠杆菌内折叠成它们的活性构象；3）可以促进二硫键的正确形成，因为周质间隙提供比细胞质更具氧化性的环境；4）由于潜在的对宿主产生毒性作用，毒性酶如核酸酶或蛋白酶不能在细胞质中生产；和5）易于纯化。

为了将蛋白质靶向周质，将它们作为与遵循不同分泌途径（例如，Sec、Tat和SRP）的信号肽序列（例如，PelB、OmpA、DsbA、TorA和MalE）的融合体表达。其他策略包括：a.修饰信号肽以提高易位；b.在大肠杆菌中使用异源信号序列；c.共表达周质侣伴蛋白（例如，Dsb家族蛋白）；d.蛋白酶-阴性突变体株以减少蛋白水解作用。

在多数情况下，对于细胞质生产来说将重组蛋白输出至大肠杆菌周质是优选的。然而，当蛋白质被过表达时，输出效率显著降低并且失去该系统的一些优势。为了避免过表达信号肽-重组蛋白融合体之后宿主的易位机制过载，已经尝试使用来自分泌途径的相应的转位子（translocons）来补充天然分泌机制。

与分泌至周质相比，胞外生产重组蛋白具有几种优势。胞外生产不需要外膜破坏来回收目标蛋白，并且因此它避免了通过周质蛋白酶的胞内蛋白水解作用并使得能够连续生产重组蛋白。

已经应用了多种方法来促进由大肠杆菌胞外分泌重组蛋白。这些方法包括使用生化药剂、物理方法（渗透压冲击、冻融）、溶菌酶处理和氯仿冲击。然而，仅可以在收获细胞后应用这些方法。除了一小类蛋白质如毒素和溶血素外，大肠杆菌通常不会胞外分泌蛋白质。一般地，从周质向培养基移动重组蛋白是损害外膜的完整性的结果。

可以通过多种方法实现损害细菌外膜的完整性。一种方法涉及将产物融合到通常分泌到培养基中的载体蛋白（例如，溶血素）上，或融合到在外膜上表达的蛋白（例如，OmpF）上。

还可以通过共表达kil或编码跨膜蛋白TolA第三拓扑结构域（TolAIII）的基因或来自菊欧文氏菌（E.chrysanthemi）EC16的外基因（out genes）将分泌到大肠杆菌周质的蛋白质释放到培养基中。还可以在大肠杆菌中胞外生产重组蛋白中使用细菌素释放蛋白（BRP）。

胞外生产目标蛋白的另一种方法使用L-型细胞，即细胞壁较少或细胞壁缺陷细胞。已构建了外膜蛋白（omp、tol、lpp、env）的敲除体并且已将相应的渗漏株用于促进分泌性重组蛋白表达。

大肠杆菌K12是GRAS生物体，这使它成为用于大规模生产治疗性蛋白质的安全系统。然而，通常认为K12不是分泌性重组蛋白表达株。生产如在本发明中所描述的有效分泌型大肠杆菌K12菌株的方法是将信号肽-蛋白质融合体和过表达转位子组件的可能与膜缺陷型突变体相结合。