[发明专利]囊泡的制造方法

说明书

技术领域

本发明涉及磷脂囊泡(脂质体)制剂的制造方法。特别涉及，比现有技术效率更高地制造医疗领域中替代输血而使用的人工载氧体(血红蛋白囊泡)的浓稠分散液的方法。

背景技术

现行的献血-输血系统作为医疗上不可缺少的技术而确立。但是伴随着各问题(感染、保存期限、献血人数的减少等)，替代输血的输液的探索成为紧急课题。特别是寻求实现掌握着运载氧功能的红血球的替代品。红血球中高浓度地含有的血红蛋白(Hb)为氧结合蛋白质，所以利用该血红蛋白的人工红血球的开发取得进展。由红血球通过精密的精制，能够从血红蛋白中将病原体、血型物质完全地去除。作为利用血红蛋白的人工载氧体，除了对血红蛋白加入化学修饰的形式(水溶性高分子结合型、分子内交联型、聚合型)之外，已知有在磷脂囊泡或高分子胶囊的内水相中内包有高纯度血红蛋白的血红蛋白囊泡等。纵观世界，领先的是修饰血红蛋白溶液的开发，虽然有到达临床试验的最终阶段的物质，但由于出现了没有预料到的副作用而中断开发的案例相继出现，因此不断地淘汰。这是由于基于红血球的生理学意义的结构的缺陷。红血球为直径约8μm的中部凹陷的圆盘状粒子，具备将本来具有毒性的血红蛋白(分子量64,500)的高浓度溶液(约35%)内包于红血球膜的结构。只是对血红蛋白进行化学修饰并不能将血红蛋白的毒性完全地排除(非专利文献1；酒井宏水、土田英俊.ファルマシア2009;45:23-28)。

历史上，在60年代后期公开有：作为两亲性分子的磷脂在水中自缔合形成双分子膜，从而形成为小泡结构(磷脂囊泡、脂质体)；从70年代后期起进行了将血红蛋白内包于该磷脂囊泡的尝试，但由于粒径控制等调制难题、得不到充分的手段抑制血浆蛋白质相互作用导致的凝集，所以没能实用化(非专利文献2：Djordjevich L&Miller IF.Fed Proc.1977;36:567)。然而之后，公开有通过“挤出法,Extrusion method”用磷脂双分子膜将高浓度血红蛋白溶液覆盖的技术，特别是实现了能够容易地通过毛细血管的粒径的控制、提高血中分散稳定度的血红蛋白囊泡(非专利文献3：Sakai H,Hamada K,Takeoka S,Nishide H,Tsuchida E.Biotechnol Prog.1996;12(1):119-125)。将聚乙二醇配置于粒子表面而得到囊泡粒子间的凝集抑制和分散稳定度提高的效果，将氧实质上完全地由溶液去除，由此能够以溶液的状态在室温下长期保存(专利文献1；日本专利第3466516号公报)。动物投药实验全面发展，作为输血替代的安全性、运载氧功能的细节变得明确(非专利文献4：Sakai H,Sou K,Horinouchi H,Kobayashi K,Tsuchida E.J Intern Med.2008;263(1):4-15)。到目前为止，已经研究了作为失血性休克时的复苏液的利用、作为手术中的频繁出血中的补充给予(血液稀释)、体外循环回路(人工心肺)的补充液的利用法等，证实有充分的运氧功能。另外，对于输血不能治疗的疾病，已经研究了通过对心肌梗塞、脑梗塞模型的给予而防止梗塞病灶的扩大，对于带蒂皮瓣的缺血性区域的氧供给、利用肿瘤组织的氧化进行的放射线治疗效果的改善、作为移植用器官、培养细胞中的氧供给源的利用法等(非专利文献5：Tsuchida E,Sou K,Nakagawa A,Sakai H,Komatsu T,Kobayashi K.Bioconjug Chem.2009;20(8):1419-40)。

发明内容

发明要解决的问题

作为磷脂囊泡的制造方法，已知有超声波照射法、使用有机溶剂的反相法、使用表面活性剂使之分散后将其透析去除的方法等(非专利文献6：「リポソーム」野島庄七、砂本顺三、井上圭三著、南江堂、1988)。但是，将血红蛋白这样的功能蛋白质进行处理并且以血管内给予作为前提的制剂的制造中，有工序中蛋白质变性、残留物质的担心，这些方法并不合适。另外，与通常的脂质体制剂相比以大量给予作为前提的人工红血球制剂的制造方法效率极低。作为表示人工红血球粒子性能之一的参数，使用相对于单位脂质重量的血红蛋白重量的比。该值越高则越能够有效地运送与血红蛋白结合的氧。因此，需要尽可能地提高粒子的内水相的血红蛋白浓度，总而言之在高浓度(例如，35-45g/dL)的血红蛋白溶液中分散复合脂质、形成囊泡时以浓度高的状态将血红蛋白内包成为必要条件。高浓度血红蛋白溶液的粘度高，在其中使脂质粉末分散时粘度进一步提高。