[发明专利]dsRNA内切核糖核酸酶

权利要求书

1.一种在dsRNA切割中显示序列特异性的dsRNA内切核糖核酸酶和/或其在dsRNA切割中显示序列特异性的衍生物和/或变体，所述酶含有位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环。

2.权利要求1的dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体，其中位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环具有这样的dsRNA内切核糖核酸酶氨基酸序列，所述氨基酸序列与在和dsRNA复合的内切核糖核酸酶Mini III的结构模型中位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环相对应。

3.权利要求1或2的dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体，其中位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环与由以下片段形成的位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环相对应：SEQ ID NO3所示的来自具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)的内切核糖核酸酶FNU的片段和/或SEQ ID NO4所示的来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的内切核糖核酸酶BSU的片段和/或SEQ ID NO5所示的来自蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的内切核糖核酸酶BCE的片段。

4.权利要求1-3的dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体，其包含SEQ ID NO1的来自枯草芽孢杆菌的dsRNA内切核糖核酸酶BSU的氨基酸序列的序列或片段，所述序列或片段在dsRNA切割中显示序列特异性。

5.权利要求4的dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体，特征在于其包含取代D94R。

6.权利要求1-3的dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体，其包含来自具核梭杆菌的内切核糖核酸酶FNU或来自具核梭杆菌的内切核糖核酸酶FNU的片段，所述酶或片段在dsRNA切割中显示序列特异性。

7.权利要求1-3的dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体，其包含来自蜡样芽孢杆菌的内切核糖核酸酶BCE或来自蜡样芽胞杆菌的内切核糖核酸酶BCE的片段，所述酶或片段在dsRNA切割中显示序列特异性。

8.获得在dsRNA切割中显示序列特异性的dsRNA内切核糖核酸酶的方法，该方法包括下列步骤：

a) 选择包含形成位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环的氨基酸序列的dsRNA内切核糖核酸酶、其功能变体和/或衍生物，其中所述环由dsRNA内切核糖核酸酶的氨基酸序列形成，其与通过Mini III内切核糖核酸酶和dsRNA的复合体的三维模型确定的位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环相对应；

b) 克隆编码dsRNA内切核糖核酸酶、其功能变体和/或衍生物的基因或其片段，所述酶、其功能变体和/或衍生物包含形成位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环的序列。

9.权利要求8的获得dsRNA内切核糖核酸酶的方法，其中所述方法包括在步骤b)后的下一步骤c)，表达步骤b)中所获基因或其片段编码的蛋白。

10.权利要求9的获得dsRNA内切核糖核酸酶的方法，其中步骤c)后跟随步骤d)，在步骤d)中测定分离的dsRNA内切核糖核酸酶的序列特异性。

11.权利要求8-10的获得dsRNA内切核糖核酸酶的方法，其中形成位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环的氨基酸序列，与通过以下片段形成的位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环相对应：SEQ ID NO3中所示的来自具核梭杆菌的内切核糖核酸酶FNU的片段和/或SEQ ID NO4中所示的来自枯草芽孢杆菌的内切核糖核酸酶BSU的片段和/或SEQ ID NO5中所示的来自蜡样芽孢杆菌的内切核糖核酸酶BCE的片段。

12.获得具有对dsRNA序列特异性切割的序列选择性改变的dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体的方法，该方法包括下列步骤：

a) 对于权利要求8-11的方法中所获得的dsRNA内切核糖核酸酶，在编码与位于dsRNA大沟内的环相对应的氨基酸序列的核苷酸序列中引入变化；

b) 表达来自步骤a)所获核苷酸序列的dsRNA内切核糖核酸酶的衍生物和/或变体，和

c) 鉴定dsRNA内切核糖核酸酶的衍生物和/或变体的改变的序列特异性。