[发明专利]dsRNA内切核糖核酸酶

说明书

发明领域

本发明主题为显示双链RNA (dsRNA)序列特异性切割活性的dsRNA内切核糖核酸酶、获得dsRNA内切核糖核酸酶的方法、获得具有在dsRNA切割中序列选择性改变的dsRNA内切核糖核酸酶衍生物和/或变体的方法、基因构建体、宿主细胞、编码dsRNA内切核糖核酸酶的基因在生产dsRNA内切核糖核酸酶中的用途、试剂盒和显示dsRNA内切核糖核酸水解活性的酶。

背景技术

分子生物学的基本工具之一为具有明确定义活性的蛋白，其用于例如基因工程、诊断学、医学和多种产品的生产和加工工业。

DNA限制性内切核酸酶为序列依赖性酶，其识别和切割双链DNA的特定序列。还已经知道在给定序列切割RNA的酶，然而，这样的酶作用于RNA的单链位点。这些酶的实例包括噬菌体蛋白RegB (在序列GGAG的中间切割单链RNA)和核糖核酸酶Y (在富含A或AU的序列中切割单链RNA)。这些酶需要额外的决定因素以便有效切割，例如RNA二级结构和在RegB的情况下与核糖体蛋白S1的相互作用(Lebars, I.,等, J Biol Chem (2001) 276, 13264-13272；Saida, F.等, (2003) Nucleic Acids Res, 31, 2751-2758和Shahbabian, K.等, The EMBO Journal (2009) 28, 3523 - 3533)。还尝试了改变核糖核酸酶T1和核糖核酸酶MC1的特异性(Hoschler, K.等 J Mol Biol, (1999) 294, 1231-1238；Numata, T.等, Biochemistry, (2003) 42, 5270 - 5278)。在这两种情况下，产生了特异性增强(从一个核苷酸到两个核苷酸)的酶变体(Numata, T.等, Biochemistry, (2003) 42, 5270-5278；Czaja, R.等, Biochemistry, (2004) 43, 2854-2862；Struhalla, M.等 Chembiochem, (2004) 5, 200-205)。然而，所有这些核糖核酸酶的序列特异性仍非常有限，这使得它们不适合在与DNA限制酶的应用相似的应用中作为分子生物学工具。

核糖核酸酶III为切割双链RNA (dsRNA)的核酸酶的原型，并且为核糖核酸酶III超家族蛋白的创始成员，该家族蛋白共有一个进化上保守的催化结构域。基于存在的额外的结构域，它们被分为四类。第1类，即传统的核糖核酸酶III酶，具有一个双链RNA结合结构域(dsRBD)和单一的核糖核酸酶III结构域。第2类和第3类酶分别以Drosha和Dicer为代表，二者均包含两个核糖核酸酶III结构域以及单一的dsRBD。此外，属于第2类的酶具有额外的结构域，例如聚脯氨酸结构域，并且属于第3类的DExD解旋酶具有DUF283和PAZ结构域。第4类，被称为Mini III，包括由核糖核酸酶III结构域单独组成的酶。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) Mini III蛋白的天然底物为23S前-rRNA，其中该分子的3′和5′末端被除去产生成熟的23S rRNA。该酶的切割位点是已知的，然而在双链前-rRNA的切割位点附近，23S前-rRNA的一个片段形成不规则螺旋，推测其为底物识别所必需的(Redko, Y.等, Molecular Microbiology, (2008) 68 (5), 1096-1106)。此外，Mini III的体外内切核糖核酸水解活性被证明受与23S rRNA 3′末端结合的核糖体蛋白L3刺激。存在蛋白L3通过改变RNA的构象促进底物切割的间接证据(Redko, Y.等, Molecular Microbiology, (2009) 71 (5), 1145-1154)。