[发明专利]改良型腈水合酶

说明书

技术领域

本发明涉及改良型(变异型)的腈水合酶及其制造方法。进而涉及编码该酶的基因DNA、包含该基因DNA的重组载体、和具有该重组载体的转化体以及酰胺化合物的制造方法。

背景技术

近年发现了酶腈水合酶、即具有将腈基水合并转换为酰胺基的腈水合活性的酶，公开了使用该酶或含有该酶的微生物菌体等通过腈化合物而制造对应的酰胺化合物的方法。已知该制造方法与现有的化学合成法相比较，由腈化合物向对应的酰胺化合物的转化率和选择率高。

作为生产腈水合酶的微生物，可列举出例如：属于棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、根瘤菌属(Rhizobium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)等的微生物。其中，玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J1株用于丙烯酰胺的工业生产中，其有用性已被证实。另外，编码该菌株所产生的腈水合酶的基因也已明确(参照专利文献1)。

另一方面，不仅利用由自然界中存在的微生物分离的腈水合酶、其基因，还出于改变腈水合酶的活性、底物特异性、Vmax、Km、热稳定性、对底物的稳定性、对生成物的稳定性等目的，尝试了向腈水合酶中导入变异(参照专利文献2)，本发明人等取得了使耐热性或酰胺化合物耐性均提高了的腈水合酶基因(参照专利文献3和4)。

但是，从催化剂成本等生产成本的观点出发，开发耐热性和酰胺化合物耐性更进一步提高、或在高温下能够反应的腈水合酶并用于酰胺化合物的制造是非常有用的；从反应时的酶量的削减和成本削减等观点出发，期望开发而获得具有这样的性能的酶。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第3162091号公报

专利文献2：国际公开第2004/056990号小册子

专利文献3：国际公开第2005/116206号小册子

专利文献4：日本特开2007-143409号公报

发明内容

发明要解决的问题

因此，本发明的目的在于通过腈水合酶的改良，提供耐热性、酰胺化合物耐性以及高温累积性进一步提高了的具有腈水合酶活性的蛋白质。另外，本发明的目的在于提供编码该蛋白质的基因DNA、包含该基因DNA的重组载体、包含该重组载体的转化体、从该转化体的培养物中提取的腈水合酶及其制造方法。进而，本发明的目的在于提供使用了该培养物或该培养物的处理物的酰胺化合物的制造方法。

用于解决问题的方案

本发明人等为了解决上述问题进行了深入的研究。结果发现，在野生型腈水合酶的氨基酸序列中将特定的氨基酸残基置换为其他的氨基酸残基而成的蛋白质不仅具有腈水合酶活性，耐热性、酰胺化合物耐性和高温累积性也提高了，至此完成本发明。

即，本发明如下。

(1)以下(A)或(B)的蛋白质；

(A)蛋白质，其特征在于，包含在野生型腈水合酶的氨基酸序列中下述(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的氨基酸残基被置换为其他的氨基酸残基、进而选自由下述(f)～(q)所组成的组的至少一个氨基酸残基被置换为其他的氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性；

(a)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数167残基下游的氨基酸残基、

(b)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数219残基下游的氨基酸残基、

(c)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数57残基下游的氨基酸残基、

(d)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数114残基下游的氨基酸残基、

(e)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数107残基下游的氨基酸残基、

(f)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数218残基下游的氨基酸残基、

(g)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数190残基下游的氨基酸残基、

(h)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数168残基下游的氨基酸残基、