[发明专利]具有来自IFNα2的SAR元件的表达系统

说明书

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2011年4月13日提交的美国临时专利申请USSN61/474,879的权益，所述申请的全部内容以引用的方式纳入本文。

技术领域

本发明涉及用于增强蛋白表达的多核苷酸以及涉及包含所述多核苷酸的表达系统。

背景技术

哺乳动物细胞中高水平和稳定的重组蛋白（r-蛋白）生产对于具有成本效益的生物治疗剂制造是重要的。S/MAR（支架/基质附着区）是富含AT（70%）的序列，其被认为在染色质功能中起到许多重要作用。除了其结构功能外，S/MAR在基因表达的时间和空间组织上起重要作用（Alvarez2000;Liu1997）。因此，在表达载体中包括S/MAR序列可以帮助提高表达水平并防止转基因的沉默（Phi-Van1990;Jenke2004;Zahn-Zabal2001;Kim2004）。已经证明MAR元件可在整合到宿主基因组后或作为附加型载体的一部分起作用（Halweg2005;Girod2005）。

基因组元件例如UCOE（来自Millipore）或MAR（来自Selexis）是可以利用的，并且已经证实当在用于产生稳定细胞系的表达载体中以顺式或反式提供所述元件时可增强表达水平和稳定性。在人基因组中存在可被纳入到表达载体用于增强克隆细胞系的生产力和稳定性的许多S/MAR（Girod2007）。但是，这些序列并没有全部都显示出有益的效果（Sass2005）并且这些序列经常非常大（1.5-4kb），因此将其纳入到表达载体中是不实际的。需要鉴定短的（<1kb）且仍然有效的S/MAR序列，但是实现这一目的的唯一方式是试错法。

发明内容

现已发现来自人干扰素α2基因的SAR3区域的短的人基因组核苷酸序列可容许在没有药物选择的情况下增强表达稳定性，并容许产生用于产生重组蛋白的稳定克隆或稳定细胞池。虽然可以产生稳定克隆，但是产生稳定细胞池的能力减轻了产生稳定克隆的负担。

因此，在本发明的一方面中，提供了分离的多核苷酸，其包含不多于755个核苷酸并且包含来自SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的至少500个连续的核苷酸。

在本发明的另一方面中，提供了用于在宿主细胞中产生重组蛋白的表达系统，其包括：编码目的蛋白的基因；用于操纵所述表达系统的核苷酸序列；和，以顺式方式纳入所述表达系统中用于增强所述基因表达的表达增强子，所述表达增强子包含来自人干扰素α2上游支架附着区3（SAR3）的核苷酸序列，其包含不多于755个核苷酸并且包含来自SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的至少500个连续的核苷酸。

在本发明的另一方面中，提供了包含本发明的表达系统的宿主细胞。

在本发明的另一方面中，提供了一种产生重组蛋白的方法，其包括：用本发明的表达系统转染宿主细胞；在适于表达所述基因的条件下培养所述宿主细胞以产生所述目的蛋白；和，回收所述目的蛋白。

在本发明的另一方面中，提供了本发明的多核苷酸以顺式方式在用于产生重组蛋白的表达系统中作为表达增强子的用途。

所述分离的多核苷酸包含不多于755个核苷酸并且包含来自SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的至少500个连续的核苷酸。优选地，所述分离的多核苷酸包含来自SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的至少550、600、650、700或750个连续的核苷酸。所述分离的多核苷酸可以以顺式方式纳入所述表达系统中用于以所述表达系统转染的宿主细胞中增强重组蛋白表达。有利地，甚至可以在没有药物选择的情况下实现所述表达增强。

所述表达系统包含用于编码目的蛋白的基因。一些具体的目的蛋白包括例如单克隆抗体（例如曲妥单抗）、红细胞生成素、干扰素、血管内皮生长因子、干细胞生长因子、生长激素、胰岛素样生长因子结合蛋白、调节蛋白（例如cumate操纵子、四环素阻抑蛋白、类固醇激素受体、跨膜受体）等。目的蛋白的氨基酸序列和编码这些蛋白质的基因的核苷酸序列在本领域中通常是已知的。