[发明专利]酶功能改变方法及其突变体

说明书

技术领域

本发明涉及醇脱氢酶的辅酶依赖性的改变方法，特别是中链脱氢酶/还原酶（MDR：Medium-chain Dehyrdrogenase/Reductase）的辅酶依赖性的改变方法。

背景技术

一般而言，在使用了氧化还原酶的光学活性醇类的制造中辅酶是必要的，因此为了避免因反应进行而引起的辅酶枯竭，与氧化还原并行而进行辅酶的有效率的再生是重要的课题。作为光学活性醇类的制造中必要的辅酶，可举出还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH，其中，将氧化型记为NADP+）或者还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH，其中，将氧化型记为NAD+）等的吡啶核苷酸辅酶。作为将这些辅酶再生的方法，例如，周知使用葡萄糖脱氢酶（GDH）、甲酸脱氢酶（FDH）等的方法。

以往，尽管存在具有优异的物性（稳定性、耐溶剂性、耐氧化性）、比活性的醇脱氢酶，但是其辅酶依赖性未被最优化，即使将NADPH或者NADH中的任一个再生，光学活性醇类的生产率也受到限制。考虑如果能够将醇脱氢酶的辅酶依赖性最优化为辅酶再生酶的辅酶依赖性，即NADPH型或NADH型中的任一个，则在光学活性醇等的制造中的工艺最优化会变得容易，能够提供更有效率的制造方法。

通过突变筛选取得辅酶依赖性被转换的酶是需要庞大的劳力的，因此进行了考虑酶的立体结构信息来合理地设计辅酶依赖性被转换的酶突变体的尝试（专利文献1、非专利文献1）。

醇脱氢酶（ADH）也可以说是通过该逻辑设计来取得辅酶依赖性被转换的突变体的代表性酶家族。其中，关于氨基酸残基数是250左右的短链脱氢酶/还原酶（SDR：Short-chain Dehydrogenase/Reductase）家族的酶，近年已报道了成功地进行辅酶依赖性的转换的例子（非专利文献2、非专利文献3）。但是，关于氨基酸残基数为350左右的中链脱氢酶/还原酶（MDR）家族，没有相同的报告例。

专利文献

专利文献1：国际公开第03/004653号小册子

非专利文献

非专利文献1：Penning T.M.等著，“Chem.Rev.”，2001年，第101卷，第3027-3046页

非专利文献2：Machielsen R.等著，“Eng.Life Sci.”，2008年，第9卷，第38-44页

非专利文献3：Zhang R.等著，“Appl.Environ.Microbiol.，2009年，第2176-2183页

发明内容

本发明的课题为将醇脱氢酶对NADPH或NADH中的任一个的依赖性最优化，提高使辅酶再生系统共同作用时的光学活性醇类的生产率。

但是，不可能将种类、同源性不同的酶的逻辑设计直接适应于MDR。进一步地，作为醇脱氢酶，使用由约350个氨基酸残基构成的MDR（中链脱氢酶/还原酶）家族酶的情况下，导入突变的位置的候补即使在导入1个突变的情况下也存在350处，在导入多个突变的情况下会存在庞大数量的候补。进一步地，在各自的位置中，能够向至少19种氨基酸进行置换，从这些无数的候补中鉴别使对辅酶的依赖性转换而成的突变体是非常困难的。

本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果开发了新的变换属于MDR（中链脱氢酶/还原酶）家族的酶的辅酶依赖性的酶改变方法，成功地将导入突变的位置从多达350处的候补缩小成4处，且从19种存在的天然氨基酸中确定了最优的氨基酸来作为突变后的氨基酸。由此，成功地从NADH/NAD+依赖性MDR（中链脱氢酶/还原酶）家族酶取得的NADPH/NADP+依赖性酶突变体，并从NADPH/NADP+依赖性MDR（中链脱氢酶/还原酶）家族酶取得NADH/NAD+依赖性酶突变体。

即，本发明涉及：

[1]一种蛋白质，属于中链氧化还原酶家族，并具有选自下述的（a）～（d）中的至少一种氨基酸残基：

（a）与序列号1的Asp-201在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Ala或Ser，

（b）与序列号1的Lys-202在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Arg，

（c）与序列号1的Lys-203在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Ser，以及，

（d）与序列号1的Ala-206在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Lys;