[发明专利]分离具有已知遗传元件的选择的无标记微生物

权利要求书

1.一种用于从微生物的混合培养物中分离选择的微生物的方法，包括以下步骤：

a）提供含有所述选择的微生物的微生物混合培养物，其中所述选择的微生物包含一个或多个核酸分子，其中所述核酸分子包含至少15个核酸碱基对的已知的独特连续序列，并且其中所述选择的微生物的频率小于10^-3，

b）在生长培养基中连续稀释所述混合培养物以提供稀释的培养物；

c）孵育所述稀释培养物以容许所述微生物生长；

d）在由步骤（c）获得的所述稀释培养物中检测所述核酸分子的存在或不存在以使得能够在所述混合培养物中测定所述选择的微生物的所述频率，并且确定其中检测到所述核酸分子的最多稀释的培养物（P），以及确定其中检测不到所述核酸分子的最少稀释的培养物（N），其中P和N之间的稀释因子为D并且培养物N相对于未稀释混合培养物的总稀释因子为Dt；

e）制备和孵育具有稀释Dt的复制稀释培养物；

f）在由步骤（e）得到的复制稀释培养物中检测所述核酸分子的存在或不存在，其中与培养物P相比，在所述复制稀释培养物中所述选择的微生物的所述频率增加；

g）选择含有所述核酸分子的复制稀释培养物并使用所述选择的培养物重复步骤（e）至（g），其中所述复制稀释培养物的所述总稀释因子（Dt）增加了所述因子D，并且其中重复步骤（e）至（g）直到包含所述核酸分子的所述选择的微生物的所述频率大于10^-3，优选地大于10^-1；

h）筛选由步骤（g）获得的复制稀释培养物的单一菌落并分离包含所述核酸分子的所述选择的微生物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤a）中所述选择的微生物的所述频率在10^-4和10^-7之间。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述选择的微生物为微生物的缺失突变体和/或插入突变体。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述选择的微生物为细菌细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述细菌细胞属于热厌氧杆菌科。

6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述细菌细胞属于热厌氧杆菌属。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述核酸分子编码酶。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述酶选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述酶催化了产生马来酸、天门冬氨酸、丙二酸、丙酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、乙酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、烟酸、葡糖二酸、葡糖酸和乳酸、氨基酸、醇、乙偶姻、糠醛和左旋葡聚糖所需的代谢步骤。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，通过PCR检测所述核酸分子。

11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中通过杂交至所述核酸分子检测所述核酸分子。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一个或多个核酸分子包含至少两个核酸分子，其中所述两个分子中的一个包含至少15个核酸碱基对的已知独特连续序列，并且其中所述至少两个分子被包含在含有50至10,000个核酸碱基对、优选地150至3,000个核酸碱基对、更优选地150至1500个核酸碱基对的较大核酸分子内。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，D为10。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，在步骤（e）中制备的复制培养物的数量为2至500。

15.根据权利要求3所述的方法，其中，微生物的所述突变体由同源重组获得。