[发明专利]分离具有已知遗传元件的选择的无标记微生物

说明书

技术领域

本发明涉及用于分离包含已知遗传元件的微生物的方法，该有机体例如为无抗生素标记的突变细菌细胞或在包含所需基因片段的筛选研究中的有机体。

背景技术

基因的无标记删除

抗生素抗性或其他的可选择标记基因被常规地用于通过同源重组选择异源基因的染色体插入或天然基因的删除（缺失）以创建细菌的新菌株。抗生素抗性基因在宿主染色体上的存在减少了各种可在细胞中传播的质粒，因为这些通常依赖于用于其选择和维持的相同基因。含有染色体抗生素抗性基因的基因修饰的细菌不希望用于生物生产，因为染色体DNA将作为低级别的污染物存在于最终产物中，具有抗生素抗性基因转移至人类或环境中的致病细菌的风险。组成型表达的标记基因的插入也可以改变相邻的染色体基因的表达。因此，将基因插入细菌的染色体或从细菌的染色体删除基因从而产生无抗生素抗性基因或其他可选择标记基因的菌株的快速方法具有显著优点[1]。

用于未标记的（即，没有可选择标记基因）的染色体基因融合的一种策略依赖于通过单一的同源重组事件插入质粒，随后通过第二次重组事件（解离，resolution）移除质粒以希望地产生所需的基因型[1-3]。该方法的主要缺点是，如果该插入或删除降低了细胞的适应度，那么解离事件将主要再生野生型而非突变的基因型并因此可以是无效的。

可替代的方法是靠近（by）同源染色体区域侧接（flank）插入抗生素抗性基因，其中位点特异性重组酶（SSR）的识别位点直接侧接抗生素抗性基因。染色体整合策略包括使用PCR产物和噬菌体编码的重组功能的传统RecA介导的同源重组和重组工程，包括ET克隆，其利用噬菌体Rac的RecE/RecT或噬菌体λRed重组[4]。用于抗生素基因切除的SSR/靶标位点的实例分别包括噬菌体P1的Cre/loxP[5]、大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草杆菌（Bacillus subtilis）的Xer(Rip)/cis[1,6]、噬菌体λ的Xis/attP[7]以及酵母酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和鲁氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）的FLP/FRT[8]和R/RS[9]。也可以采用转座子例如苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的Tn4430[10]和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的热稳定滚环质粒[11]的重组功能。

这些系统的使用依赖于这些因素在被修饰的有机体中的功能。对于一些有机体，由于高或低的温度最适度、对高或低的pH的要求以及盐的极端浓度或阻碍重组酶的功能的其他因素，这种系统将不能工作。当使用转座子或质粒时，需要这些元件在目标有机体中是功能性的。因为在许多有机体中这些元素还没有被确定，仍然需要用于检测基因插入事件的其他方法。可替代的策略是使用微生物对卤代化合物例如卤代乙酸或5-氟-乳清酸的敏感性。5-氟-乳清酸可以被用于反向选择pyrF基因的存在，因为pyrF的产物将5-氟-乳清酸转换成有毒的化合物5-氟尿嘧啶。一旦pyrF基因从目标微生物的染色体删除，pyrF基因可以被用作亦或质粒上亦或染色体整合上在不同位置的选择标记。该方法被广泛用于酵母中并在热纤梭菌[12]中被证明。为了该方法有效，选择的有机体需要对卤代化合物敏感。包括马瑞氏热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter mathranii）BG1[13]在内的一些工业微生物对毒性化合物如卤化的化合物高度耐受，并因此其使用是不可能的。一般地，亦或通过使用围绕产生反应中间体的新的途径亦或通过产生减少这种化合物的毒性的修饰酶[14]可以使微生物变成对卤代化合物的毒性作用较不敏感。此外，一旦已使用pyrF基因，需要在其可以被再次用作二次突变的选择标记之前移除。

在植物中，抗生素抗性标记的去除也是非常重要的。有几种方法来避免或摆脱可选择的标记基因。已经开发了将容许在植物中与其插入一样的效率地去除DNA的方法，如使用位点特异性重组、转座和同源重组。研究人员还描述了无有害的生物活性的几种替代标记基因。这些非细菌基因的存在使得植物能够代谢通常对它们有害的无毒药剂[15]。

分离含有编码商业上重要产品例如酶的基因的菌株