[发明专利]蛋白质诱导的多能细胞技术及其用途

说明书

发明背景

1.技术领域

本发明涉及蛋白质转导及其用途。更具体而言，本发明涉及蛋白质诱导的多能干细胞（piPSC）技术及其应用，所述piPSC技术在一周内以接近100%的转换效率生成高品质piPS细胞。本发明还涉及无饲养者piPSC培养条件和无需集落挑选和克隆扩增的全皿扩增及其应用。

2.相关技术描述

胚胎干（ES）细胞是衍生自胚胎的干细胞。对于目前技术状态，人胚胎干细胞系的制备需要破坏人胚胎，产生关于人ES细胞研究的有争议的伦理问题。ES细胞通过两个区别性质不同于其他类型的细胞：多能性和无限的自我更新。在限定条件下，ES细胞能够无限制地更新自身，允许ES细胞用作研究和再生医学的有用工具，因为我们可以产生无限的ES细胞用于连续研究或临床用途。ES细胞还能够分化成三个主要胚层的所有衍生物：外胚层、内胚层和中胚层，包括成体体内超过220个细胞类型。多能性使ES细胞不同于成体组织中发现的成体干细胞；虽然ES细胞可以生成体内的所有细胞类型，但成体干细胞是多潜能的，并且仅能够产生在这个组织类型内的有限数目的细胞类型。

ES细胞疗法可以用于再生医学和组织替代物用于损伤或疾病治疗，例如血液、免疫系统和不同疾病相关遗传疾病、癌症、心血管疾病、青少年糖尿病、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病、伤口愈合、类风湿性关节炎、脱发、耳聋、失明、肌萎缩侧索硬化、肌营养不良和脊髓损伤。除了干细胞疗法的伦理关注外，还存在与异体干细胞移植相关的移植物抗宿主病的技术问题。因为用于再生医学的ES细胞来自人胚胎，所以当对个别患者执行ES细胞移植用于疾病治疗时，免疫排斥始终是重大问题。ES细胞的其他潜在用途包括早期人发育的探索、遗传疾病的研究、毒物学测试和药物筛选的体外系统。

用于培养ES细胞的过程是非常繁重的。通过将内细胞团转移到塑料实验室培养皿内分离人ES细胞。培养皿的内表面一般由饲养层：小鼠胚胎皮肤细胞包被，所述小鼠胚胎皮肤细胞已如此处理，使得它们将不分裂，而是提供ES细胞与之附着的粘性表面。饲养细胞还将营养素释放到培养基内。研究者已设计出无需小鼠饲养细胞生长胚胎干细胞的方法。这是显著的科学进展，由于小鼠细胞中的病毒或其他大分子可能传递给人细胞的危险。

关于ES细胞扩增的过程也是非常耗时的。ES细胞形成菌落。通常，ES细胞扩增首先是选择个别ES细胞集落，并且随后扩增所选集落。这显著减慢ES细胞扩增，并且如果所选集落含有基因突变，则可以引起更高的突变率。

在2006年，Shinya Yamanaka及同事显示使用逆转录病毒将四种转录基因：Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc引入小鼠成纤维细胞内，可以生成展示多能性的经诱导的多能干细胞（iPS细胞）。这是革命性发现，因为首次显示体细胞可以再编程回到ES样细胞。iPS细胞被认为在许多方面等同于天然ES细胞，例如特定干细胞基因和蛋白质的表达、染色质甲基化模式、倍增时间、拟胚体形成、畸胎瘤形成、有活力的嵌合体形成、无限的自我更新性质和可辨性。然而，它们与天然多能干细胞的关系的完全程度仍有待评价。

认为iPS细胞技术是更少伦理争论的，因为这种技术允许无需人胚胎而生成多能干细胞。这种技术还可以允许生成患者特定ES细胞系，其可以潜在用于细胞替代治疗以治疗多种人疾病，且允许由具有多种遗传疾病的患者生成ES细胞系，并且将提供研究这些疾病和用于药物筛选的无价模型。

在2007年，几个团体显示经由四基因逆转录病毒递送由小鼠成纤维细胞生成的iPS细胞产生有活力的嵌合体。这些团体使用Nanog用于检测iPS细胞，指示Nanog是细胞多能性的主要决定子。然而，c-Myc是致癌的，并且20%的嵌合小鼠发展癌症。在后期研究中，Yamanaka报道iPSC可无需c-Myc而生成。该过程花费很多时间并且不够有效，但所得到的嵌合体不发展癌症。

同样在2007年，由人体细胞生成iPS细胞，代表用于iPS细胞技术的里程碑。然而，使用的病毒转染系统将基因插入宿主基因组中的随机位置上，并且产生关于这些iPSC的潜在治疗应用的主要关注，因为产生的细胞可能易于形成肿瘤。为了克服这些危险，腺病毒用于将必要的四种基因转运到小鼠皮肤和肝细胞的基因组内，导致与胚胎干细胞等同的细胞。因为腺病毒不与靶向的宿主组合任何其自身基因，所以消除产生肿瘤的危险，尽管这种方法仍未对人细胞进行测试。Yamanaka及几个其他实验室自那以后已证实重编程可以经由质粒完成，完全无需任何病毒转染系统，尽管效率极低。