[发明专利]哺乳动物细胞培养

权利要求书

1.一种培养表达重组蛋白的哺乳动物细胞的方法，其包括

在生物反应器中在无血清培养基中建立哺乳动物细胞培养物；

使所述哺乳动物细胞在生长期期间生长并且用无血清进料培养基的批式进料（bolus feed）补充所述培养基；和

通过用无血清灌注培养基灌注来在生产期期间维持所述哺乳动物细胞，其中在所述生产期期间的所述压积细胞体积小于或等于35%，

其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中灌注开始于所述细胞培养的第5天时或第5天时至第9天时或第9天时。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中灌注开始于所述细胞培养的第5天时或第5天时至第7天时或第7天时。

4.根据权利要求1所述的方法，其中灌注开始于所述细胞已经达到生产期时。

5.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括通过L-天冬酰胺饥饿随后用L-天冬酰胺浓度是5 mM或更小的无血清灌注培养基灌注来诱导细胞生长阻滞。

6.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括通过用L-天冬酰胺浓度是5 mM或更小的无血清灌注培养基灌注来诱导细胞生长阻滞。

7.根据权利要求5-6中任一项所述的方法，其中所述无血清灌注培养基中的L-天冬酰胺浓度小于或等于4.0 mM。

8.根据权利要求5或6中任一项所述的方法，其中所述无血清灌注培养基中的L-天冬酰胺浓度小于或等于3.0 mM。

9.根据权利要求5或6中任一项所述的方法，其中所述无血清灌注培养基中的L-天冬酰胺浓度小于或等于2.0 mM。

10.根据权利要求5或6中任一项所述的方法，其中所述无血清灌注培养基中的L-天冬酰胺浓度小于或等于1.0 mM。

11.根据权利要求5或6中任一项所述的方法，其中所述无血清灌注培养基中的L-天冬酰胺浓度是0 mM。

12.根据权利要求5所述的方法，其中在L-天冬酰胺饥饿之前和期间监测所述细胞培养基的L-天冬酰胺浓度。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述压积细胞体积小于或等于30%。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物细胞培养物在小于或等于35%的压积细胞体积下的活细胞密度是10×10⁶个活细胞/ml到80×10⁶个活细胞/ml。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述哺乳动物细胞培养物的活细胞密度是20×10⁶个活细胞/ml到30×10⁶个活细胞/ml。

16.根据权利要求1所述的方法，其中灌注包括连续灌注。

17.根据权利要求1所述的方法，其中灌注速率是恒定的。

18.根据权利要求1所述的方法，其中灌注以小于或等于1.0工作体积/天的速率进行。

19.根据权利要求1所述的方法，其中灌注以在所述生产期期间从0.25工作体积/天增加到所述细胞培养期间的1.0工作体积/天的速率进行。

20.根据权利要求1所述的方法，其中灌注以在所述细胞培养的第9天到第11天达到1.0工作体积/天的速率进行。

21.根据权利要求1或20所述的方法，其中灌注以在所述细胞培养的第10天达到1.0工作体积/天的速率进行。

22.根据权利要求1所述的方法，其中无血清进料培养基的所述批式进料开始于所述细胞培养的第3天或第4天。

23.根据权利要求1所述的方法，其中通过以至少0.5×10⁶到3.0×10⁶个细胞/mL在无血清培养基中接种所述生物反应器来建立所述哺乳动物细胞培养物。