[发明专利]无去污剂制备革兰氏阴性细菌外膜泡囊的方法

权利要求书

1.无去污剂制备在疫苗中使用的细菌外膜泡囊(OMV)的方法，所述方法包括以下步骤：

a)培养革兰氏阴性细菌群落至静止生长期；

b)在静止生长期开始后至少约1小时的时间点，在调节至或具有高于pH8.0的pH、浓度为约1-100mM的金属螯合剂的培养基中，孵育在a)中获得的细菌，以提取OMV，所述金属螯合剂优选为EDTA；以及

c)回收在b)中提取的OMV，其中所述回收至少包括从所述OMV移除所述细菌。

2.权利要求1的方法，其中所述革兰氏阴性细菌具有基因修饰，所述基因修饰导致所述细菌产生毒性降低的LPS，但是所述LPS保留至少部分它的佐剂活性；所述基因修饰优选为降低或敲除一种或多种基因的表达的修饰，所述一种或多种基因选自lpxL1和lpxL2基因或其同源物和lpxK基因或其同源物，和/或所述基因修饰为引起一种或多种lpxE和/或pagL基因表达的修饰。

3.权利要求1或2的方法，其中在b)中，将所述细菌在所述培养基中孵育的静止生长期开始后的所述时间点为约1-9小时，优选约2-5小时。

4.前述权利要求中任一项的方法，其中将所述OMV灭菌，优选通过过滤灭菌，优选使用具有小于约0.3微米小孔的滤器。

5.前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤b)中，优选为EDTA的所述金属螯合剂的浓度为约5-15mM，和/或其中所述pH为约pH7.5-pH9.5，优选约pH8.0-pH9.0，更优选约pH8.2-pH8.8，更优选约pH8.4-pH8.7。

6.前述权利要求中任一项的方法，其中a)中培养物的体积和/或b)中培养基的体积至少为约10L，更优选至少为约20L、40L、60L、80L、100L、200L、300L、400L、500L、800L、1500L、5000L、10,000L、20,000L或40,000L。

7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述革兰氏阴性细菌为奈瑟球菌属(Neisseria)或博德特菌属(Bordetella)的菌种，优选为脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)或百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)。

8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述革兰氏阴性细菌具有一种或多种降低或敲除基因产物表达的突变，所述基因产物优选选自cps、包括lpxL1、rmpM、porA、porB和opA的脂质A生物合成基因产物。

9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述革兰氏阴性细菌表达多种porA亚型。

10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述群落包含多于一种革兰氏阴性细菌的菌株，并且其中每种菌株表达不同的porA亚型。

11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述革兰氏阴性细菌表达对所述革兰氏阴性细菌而言外来的抗原。

12.前述权利要求中任一项的方法，其还包括将所述OMV与药学可接受的赋形剂组合的步骤。

13.OMV，其可通过前述权利要求中任一项的方法获得。

14.药物组合物，其包含权利要求13的OMV和药学可接受的赋形剂。

15.权利要求13的OMV或权利要求14的药物组合物，其用作药剂，其优选在脑膜炎的治疗中用作药剂。

16.在个体中诱发免疫反应的方法，所述免疫反应优选针对脑膜炎奈瑟球菌，所述方法包括向所述个体给药权利要求13的OMV或权利要求14的药物组合物。

17.权利要求13的OMV或权利要求14的药物组合物在个体中诱发免疫反应的用途，所述免疫反应优选针对脑膜炎奈瑟球菌，所述用途包括向所述个体给药权利要求13的OMV或者权利要求14的药物组合物。