[发明专利]无去污剂制备革兰氏阴性细菌外膜泡囊的方法

说明书

发明领域

本发明涉及医学微生物学和疫苗的领域。本发明特别涉及无去污剂制备在疫苗中使用的革兰氏阴性细菌外膜泡囊(OMV)的方法、可通过所述方法获得的OMV，以及包含这样的OMV的药物组合物。本发明还涉及本发明的OMV作为药剂的用途，特别是其在诱发免疫应答的方法中的用途。

发明背景

脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是可引起急性脑膜炎和败血症的人病原体，其致死率约15％[Girard等人，2006]。血清群B脑膜炎在北美洲占脑膜炎病例的30-40％[Sharip等人，2006；Kaplan等人，2006]，并且在一些欧洲国家中占高达80％[Trotter等人，2007；Gray等人，2006]，然而仍没有可用的广泛保护性疫苗。已经基于缀合至载体蛋白的荚膜多糖，研发了针对其它血清群的有效疫苗[Snape等人，2008]。对于血清群B，由于较差的免疫原性[Morley等人，2001]，以及对于疫苗接种引发的自身免疫的担心[Finne等人，1983]，该方法不可行。至今，基于外膜泡囊(OMV)的疫苗是唯一成功地控制血清群B传染病的疫苗，如在挪威、古巴和新西兰[Bjune等人，1991；Thornton等人，2006；Martin等人，1998；Sierra等人，Fredriksen等人，1991]的实例。

OMV从革兰氏阴性细菌的外膜释放，其由包含外膜蛋白的磷脂(PL)双分子层、脂多糖(LPS)和胞质组分组成[Deatherage等人，2009]。PorA蛋白被鉴定为是OMV中的主要保护性抗原，但它在传播的血清群B菌株之间是高度可变的，这使疫苗的研发复杂化[Saukkonen等人，1989；Martin等人，2006]。因此，Rijks Instituut voor Volksgezondheid en Milieu(RIVM)，即国家公共卫生和环境研究所(Bilthoven，荷兰)研发了基于表达多种PorA亚型的基因修饰的脑膜炎奈瑟球菌菌株的OMV疫苗。起初，该多价OMV疫苗由2种总共表达6种PorA亚型的三价PorA菌株制备[van der Ley等人，1995；Claassen等人，1996]，并且在II期临床试验中提供了功能性免疫原性。为了确保对于全球传播的血清群B菌株的足够覆盖，加入了第三种三价菌株[van den Dobbelsteen等人，2007]。

传统上通过去污剂提取(dOMV纯化方法)来制备OMV疫苗，以移除LPS，并增强泡囊释放。脑膜炎奈瑟球菌的LPS是高毒性的，但是需要残留量(约1％)来维持泡囊结构并辅助针对PorA的免疫应答[Arigita等人，2005；Arigita等人，2003；Steeghs等人，2004]。通过适度的去污剂浓度，dOMV纯化方法满足这些要求，然而其还有重要缺点。连同LPS，去污剂移除有助于免疫原性的PL以及脂蛋白(例如因子H结合蛋白)[Koeberling等人，2009；Koeberling等人，2008]。所产生的免疫应答直接针对特定的PorA亚型，而不引发交叉保护[Morley等人，2001；van der Voort等人，1996]。此外，LPS和PL的选择性移除改变原始的泡囊结构，并且促进聚集[Holst等人，2009；Cametti等人，2008]。为了降低LPS毒性，需要进行去污剂处理，但这具有使疫苗研发复杂化的有害的副作用。