[发明专利]在植物中产生狂犬病病毒样颗粒

说明书

技术领域

本发明涉及在植物中产生天然病毒蛋白质。更具体地，本发明还涉及在植物中产生包含天然狂犬病病毒结构蛋白的病毒样颗粒。

背景技术

疫苗接种通过诱导对象在感染前进行防御来提供针对由感染性病原体(agent)所导致之疾病的保护。常规地，这通过使用作为免疫原的感染性病原体(infectious agent)的活的减毒形式或完整的灭活形式来完成。为了避免使用完整的病毒(例如死病毒或减毒病毒)作为疫苗的危险，将重组病毒蛋白质(例如亚单位)用作疫苗。肽疫苗和亚单位疫苗均受到许多潜在的限制。亚单位疫苗可展现出较差的免疫原性(由于不正确折叠)、较差的抗原呈递或者糖类和脂质组成的差异。主要的问题是很难确保经改造蛋白质的构象模仿该抗原在其自然环境中的构象。必须使用合适的佐剂和(在肽的情况中)载体蛋白质以加强免疫应答。另外，这些疫苗主要引起体液应答，因此可能无法引发有效的免疫。亚单位疫苗对于疾病常常是无效的，但可证明完整的灭活病毒提供对所述疾病的保护。

病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)对于免疫原性组合物的内含物而言是潜在的候选物。VLP与成熟的病毒体非常类似，但是它们不含有病毒基因组物质。因此，VLP本身是非复制性的，这使得它们作为疫苗施用是安全的。另外，可将VLP改造以在VLP的表面上表达病毒糖蛋白，这是它们最天然的生理构型。此外，由于VLP类似完整的病毒体并且是多价的微粒结构，所以VLP在诱导针对糖蛋白的中和抗体中可比可溶性包膜蛋白抗原更有效。

到目前为止，已经产生了用于感染人和其他动物的超过30种不同病毒的VLP。该组最显著的特征之一是在各个病毒之结构的方面极其不同。其包括具有单衣壳蛋白、多衣壳蛋白的病毒，以及具有和没有脂质包膜的那些。

对于具有脂质包膜之病毒的VLP形成与对于具有多衣壳之病毒所产生的那些具有不同类型的技术挑战。对于这些病毒，表达系统的选择对于VLP形成的效率可以是重要的。例如，汉坦(Hantaan)病毒在哺乳动物细胞中表达时容易从基于牛痘病毒的载体中形成VLP，但是VLP形成在昆虫细胞中则相对无效(Betenbaugh M等1995，Virus Res.38，111-124)。

狂犬病病毒(rabies virus，RV)是弹状病毒科(Rhabdoviridae)的成员。像该科的大部分成员一样，RV为不分节负链RNA病毒(non-segmented，negative stranded RNA virus)，其基因组编码五种病毒蛋白质：RNA依赖性RNA聚合酶(L)；核蛋白(N)；磷酸化蛋白质(P)；位于病毒蛋白质包膜内侧的基质蛋白(M)；以及外表面糖蛋白(G)。(Dietzschold B等，1991，Crit.Rev.Immunol.10：427-439.)

用于狂犬病的基于细胞培养的疫苗局限于在细胞培养物中培养的灭活病毒株。这些疫苗包含培养在细胞培养物中的病毒。当前生物技术方法针对表达狂犬病病毒的外壳蛋白基因以开发可用作活性疫苗的安全重组蛋白质。已经显示在中国仓鼠卵巢细胞中稳定表达狂犬病病毒糖蛋白(Burger等，1991，J Gen Virol.，Feb；72(Pt2)：359-67)。获得了与从病毒感染细胞分离的与G蛋白共迁移的67K的全长糖基化蛋白质。

在昆虫细胞中狂犬病糖蛋白基因通过杆状病毒载体的表达在感染后48小时给出了总细胞蛋白质之18％的程度的蛋白质产率。Prehaud D H等(1989，Virology，Dec；173(2)：390-9)描述了将编码CVS株之G蛋白的序列放置在AcNPV多角体蛋白(polyhedrin)启动子的控制下并使用草地贪夜蛾(Spodoptera fugiperda)细胞系表达构建体。由于聚糖组分的差异，昆虫来源的蛋白质与野生型相比展现出改变的电泳迁移率。

Rupprecht等(1993，Vaccine，11(9)：925-8)表明，来源于经重组杆状病毒感染之昆虫细胞的糖蛋白(ERA株)在浣熊中作为口服疫苗是有效的。WO/1993/001833教导了在含有RNA基因组的杆状病毒表达系统中产生病毒样颗粒(VLP)，该基因组包含由狂犬病N蛋白和狂犬病M蛋白的鞘包围的3′结构域和填充结构域(filler domain)。VLP还包含狂犬病G蛋白的脂质包膜。鉴于昆虫和哺乳动物细胞系统的相对高成本，这些不是选择用于作为开发针对狂犬病之疫苗的策略的G蛋白表达的系统。