[发明专利]核酸分析方法和核酸分析装置

说明书

技术领域

本发明涉及核酸分析方法和核酸分析装置。

背景技术

近年来，作为核酸解析方法，开发出了对试样中所包含的核酸的种类和量简便地进行解析的方法。例如，如非专利文献1所记载的那样，在DNA微阵列中，预先将多种具有能够识别已知基因序列的序列的合成DNA固定在支撑基体上的规定位置，将赋予了荧光体标记的核酸试样或核酸试样的逆转录产物、扩增产物在所述支撑基体上进行杂交，然后利用荧光扫描仪获得荧光图像，从而可以由荧光强度解析何种基因以怎样的量进行了表达。此外，如非专利文献2所记载的那样，如下的定量PCR法也被用作核酸解析方法：使用作为核酸扩增反应的PCR求出扩增曲线，在试样之间对获得一定量扩增产物所必需的反应次数进行比较。进而，如非专利文献3所记载的那样，如下的所谓新一代测序法也已经实用化：在包含微粒的乳液中进行PCR反应，将大量包裹有扩增产物的微粒固定在支撑基体上后进行DNA延伸反应，从而掺入荧光体标记的核苷酸，通过观察荧光，平行性良好地进行碱基序列解析。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Science1995,Vol.270,pp467-470.

非专利文献2：Nucleic Acid Research,1992,Vol.20,pp4939.

非专利文献3：Genome Research2008,Vol.18,pp1051-1063.

非专利文献4：Nature Methods,2009,Vol.6,pp474-476.

非专利文献5：Nature Methods2010,Vol.7,pp687-692.

发明内容

发明要解决的问题

作为探索疾病相关基因的方法，将健康人和特定疾病患者的核酸试样进行比较从而找出在疾病患者中表达量显著高或显著低的基因的方法被用作常用手段。作为这样的方法，通常是首先通过微阵列选定表达量不同的候选基因，然后使用定量PCR对这些候选基因的表达量的差异进行严格确认的方法。微阵列具有如下特征：一次能够解析的基因数为数万以上，所探索的基因的包罗性高，但动态范围（Dynamic Range）为2～3.5位左右，定量性低；而定量PCR法具有如下特征：动态范围为6～7位，定量性高，但一次能够解析的基因数为400左右，包罗性低，因而上述方法是组合了各自的优点而得到的方法。因此存在如下问题：为了进行试样之间的表达比较解析，必须进行微阵列和定量PCR2个阶段的实验。而新一代测序一次能够解析的核酸片段数为数亿～数十亿条，可以通过对同一序列的核酸片段数进行计数而确定表达量，因此动态范围达到8位以上。其虽然适合于存在2万种以上的信使RNA的包罗性表达解析，但对于解析非翻译RNA、数十个碱基以下的microRNA等存在的种类数为2千种以下的核酸的表达量而言规模过大，一次解析中耗费的试剂等运行成本、花费长达数十小时的解析时间成了问题。

此外，如非专利文献4所指出的那样，在利用定量PCR、新一代测序进行表达解析时，存在如下问题：通过PCR对核酸试样进行扩增，扩增效率依赖于GC含量等碱基序列，因此，无法以相同的扩增效率扩增试样的全部核酸，核酸群体中产生偏差，无法正确解析各核酸分子的存在量的分布。

本发明的目的在于，提供一种简便的核酸分析方法，所述核酸分析方法不使用PCR等扩增反应，具有一次能够解析的核酸种类达千种以上的包罗性和动态范围达4位以上的定量性。特别是提供一种解析对象核酸为1万种以下的对于非翻译RNA、microRNA的解析极其有效的解析方法。

用于解决问题的手段

本发明涉及如下方法：通过将试样的核酸分子在空间上分离的位置上各固定一分子并使具有已知碱基序列且被荧光体标记的核酸分子与所述试样的核酸分子组进行杂交，获取荧光图像，从而以一分子的灵敏度和分辨率对核酸分子的种类和表达量进行解析。

发明的效果

根据本发明，能够不使用PCR等扩增反应而对解析对象核酸的种类和存在量兼顾包罗性和定量性地、以一分子的灵敏度和分辨率简便、迅速地进行核酸分析。