[发明专利]PRAME纯化

说明书

技术领域

本发明涉及用于PRAME的纯化的方法。

背景

“黑素瘤中优势表达的抗原”(PReferentially expressed Antigen in MElanoma)或“PRAME”是由PRAME基因编码的肿瘤抗原。

PRAME是在许多类型的肿瘤(包括黑素瘤、肺癌和白血病)中超表达的抗原(Ikeda等人，Immunity 1997, 6 (2) 199-208)。已报道了多种实体瘤和血液恶性肿瘤中的高水平的PRAME表达，所述实体瘤包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌和黑素瘤、髓母细胞瘤、肉瘤、头和颈癌、成神经细胞瘤、肾癌和肾母细胞瘤(Wilms' tumour)，所述血液恶性肿瘤包括急性成淋巴细胞性白血病和急性髓细胞性白血病(ALL和AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、霍奇金病、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和套细胞淋巴瘤(MCL)。

PRAME还以非常低水平表达于少数正常组织中，例如睾丸、肾上腺、卵巢和子宫内膜。

PRAME代表重要的抗癌免疫治疗剂。在免疫治疗中，癌抗原通常作为疫苗(例如包含蛋白或其抗原片段)引入患者，其刺激患者的免疫系统以杀死表达相同抗原的肿瘤。

生产包含癌抗原(在这种情况下为PRAME)的疫苗需要显著量的癌抗原，这进而需要抗原的大规模表达和纯化。

发明概述

PRAME在大肠杆菌(E. coli)中超表达，它在其中形成包涵体。为了从包涵体中溶解PRAME，必须将其暴露于需要阴离子去污剂和尿素的强溶解条件下。然而，这样的条件并不适合将PRAME最终配制成用于向患者注射的组合物，并且纯化的PRAME必须转移到另一种稀释剂。

本申请的发明人已经意识到，将PRAME从包含用于溶解它的阴离子去污剂的稀释剂中转移到基本上无阴离子去污剂的稀释剂中导致PRAME的聚集。该聚集随时间持续并最终导致PRAME从溶液中沉淀出来。由于该聚集(抗原大小发展)不适合在免疫治疗组合物中的应用，因此，本领域中需要用于PRAME的纯化的改进方法。

本文提供了减少PRAME聚集的方法和工艺，以及通过这些方法和工艺产生的化合物。在一个实施方案中，提供了减少蛋白在从稀释剂A至稀释剂B的稀释剂交换过程中的聚集的方法，其包括：(i) 在所述交换前向稀释剂A加入聚阴离子化合物；和(ii) 将蛋白从稀释剂A交换至稀释剂B，其中所述蛋白为PRAME。在一个实施方案中，提供了聚阴离子组合物用于减少蛋白在从稀释剂A至稀释剂B的稀释剂交换过程中的聚集的用途，其中所述蛋白为PRAME。在一个实施方案中，在所述稀释剂交换前加入聚阴离子化合物。在一个实施方案中，稀释剂A包含去污剂。在另一个实施方案中，所述去污剂是阴离子去污剂。在另一个实施方案中，所述去污剂选自：SDS、多库酯钠和十二烷基肌氨酸钠(lauryl sarcosyl)。

在一个实施方案中，稀释剂B基本上不含去污剂。

在一个实施方案中，所述聚阴离子化合物是寡核苷酸。在一个实施方案中，所述寡核苷酸的长度为5-200个核苷酸。在一个实施方案中，所述寡核苷酸包含CpG。最多在一个实施方案中，所述寡核苷酸选自：                                                

。

在一个实施方案中，所述稀释剂交换通过透析、渗滤或尺寸排阻层析实现。

在一个实施方案中，所述方法进一步包括步骤(iii)：将蛋白配制到稀释剂C中。在一个实施方案中，稀释剂C包含Tris、硼酸盐、蔗糖、泊洛沙姆和CpG。

本发明还提供如通过本发明的方法产生的包含在稀释剂C中的PRAME的组合物。

本发明还提供包含PRAME和寡核苷酸的组合物，其中所述PRAME具有10-30nm之间的颗粒大小。在另一个实施方案中，PRAME具有15-25nm之间的颗粒大小。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸包含CpG。在进一步的实施方案中，所述颗粒大小通过动态光散射测定。

本发明还提供了用于生产药学上可接受的PRAME组合物的方法，其包括步骤：(a)按照本发明的方法进行稀释剂交换；(b)将蛋白配制到稀释剂C中；和(c)将步骤(b)中产生的制剂灭菌。在另一个实施方案中，该方法包括额外的步骤(d)：将步骤(c)中产生的制剂冷冻干燥。在另一个实施方案中，步骤(c)通过过滤实现。

附图简述