[发明专利]酮异戊酸脱羧酶及其使用方法

权利要求书

1.将α-酮异戊酸转化成异丁醛的方法，包括：

a.提供多肽，其中所述多肽包含下列中的至少一种：

(i)与SEQIDNO：51、52、53、55、56、58、59、61或63或它们的活性片段至少80％同一性；或

(ii)α-酮异戊酸脱羧酶活性，大于1的α-酮异戊酸与丙酮酸的特异性比率，以及约20μM或更小的二磷酸硫胺素辅因子活化常数(K_c)；以及

b.在其中产生异丁醛的条件下使所述多肽与α-酮异戊酸接触。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽具有使用hmmsearch程序小于1E-223的KIVD簇序型HMME值。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述接触在重组宿主细胞内发生，并且其中所述多肽对于重组宿主细胞是异源性的。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述重组宿主细胞是下列属的成员：梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、志贺氏菌属(Shigella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、或糖酵母属(Saccharomyces)。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述重组宿主细胞是啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述重组宿主细胞还包含编码多肽的异源性多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；以及(c)2，3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的异源性多核苷酸，所述多肽催化异丁醛至异丁醇的底物至产物转化。

8.根据权利要求3-7中任一项所述的方法，其中所述重组宿主细胞还包含降低的或消除的丙酮酸脱羧酶活性。

9.根据权利要求3-8中任一项所述的方法，其中所述重组宿主细胞还包含在编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变、和/或替换。

10.根据权利要求3-9中任一项所述的方法，其中所述重组宿主细胞包含fra2的缺失。

11.根据权利要求3-10中任一项所述的方法，其中所述重组宿主细胞包含降低的或消除的甘油-3-磷酸脱氢酶活性。

12.生产异丁醇的方法，包括：

a.提供包含异丁醇生产途径的重组宿主细胞，所述生产途径包含多肽，其中所述多肽包含下列中的至少一种：

(i)与SEQIDNO：51、52、53、55、56、58、59、61或63或它们的活性片段至少80％同一性；或

(ii)α-酮异戊酸脱羧酶活性，大于1的α-酮异戊酸与丙酮酸的特异性比率，以及约20μM或更小的二磷酸硫胺素辅因子活化常数(K_c)；以及

b.在其中产生异丁醇的条件下使所述重组宿主细胞与碳底物接触。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述多肽具有使用hmmsearch程序小于1E-223的KIVD簇序型HMME值。

14.根据权利要求12或权利要求13所述的方法，还包括使用液-液提取来分离异丁醇。