[发明专利]酮异戊酸脱羧酶及其使用方法

说明书

政府许可权利

本发明是在根据美国能源部批准的协议DE-AR0000006的政府支持下作出的。政府拥有本发明中的某些权利。

相关申请的交叉引用

本申请涉及并要求2011年7月28日提交的美国临时专利申请61/512,866的优先权，该专利申请以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及具有适合在异丁醇生产途径中发挥作用的α-酮异戊酸脱羧酶活性的多肽。

背景技术

丁醇是重要的工业化学品，作为燃料添加剂、在塑料工业中作为化学原料、以及在食品和风味剂工业中作为食品级的提取剂是有用的。每年有100至120亿磅的丁醇通过石油化学方法被生产，并且对这种日用化学品的需求未来将很可能增加。

丁醇异构体异丁醇的化学合成的方法是已知的，例如羰基合成，一氧化碳的催化氢化(Ullmann′sEncyclopediaofIndustrialChemistry，第6版，2003，Wiley-VCHVerlagGmbHandCo.，Weinheim，Germany，第5卷，第716-719页)以及甲醇与正丙醇的格尔伯特缩合(Carlini等人，J.Molec.Catal.A.Chem.220：215-220，2004)。这些方法使用来源于石油化学品的起始材料。由植物来源的原材料生产异丁醇能够使化石燃料的使用最小化，并将代表本领域中的进步。

美国专利7,851,188描述了在重组微生物中用于生产异丁醇的酶途径。在其中描述的用于生产异丁醇的一种代谢途径中的倒数第二步是α-酮异戊酸至异丁醛的转化。本领域中仍然存在鉴定适合用于异丁醇生物合成途径中的附加的酶的需求。

发明内容

本文提供了重组宿主细胞和利用本发明所公开的多肽将α-酮异戊酸转化成异丁醛的方法。在实施例中，所述方法包括：(a)提供多肽，其中所述多肽包含下列中的至少一种：(i)与SEQIDNO：51、52、53、55、56、58、59、61或63或它们的活性片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％同一性；或(ii)α-酮异戊酸脱羧酶活性，大于约1的α-酮异戊酸与丙酮酸的特异性比率，以及约20mM或更小的二磷酸硫胺素辅因子活化常数(K_c)；以及(b)在其中产生异丁醛的条件下使所述多肽与α-酮异戊酸接触。在实施例中，所述多肽包含SEQIDNO：51、52、53、55、56、58、59、61或63的氨基酸序列。在实施例中，所述多肽包含来自格氏李斯特菌(Listeriagrayi)或解酪蛋白巨大球菌(Macrococcuscaseolyticus)的序列。在实施例中，所述多肽包含SEQIDNO：58或61的氨基酸序列。在实施例中，所述接触在小于约30mg/L、小于约20mg/L、或小于约10mg/L硫胺素的存在下发生。在实施例中，所述接触在重组宿主细胞内发生，并且其中所述多肽对于重组宿主细胞是异源性的。在实施例中，所述重组宿主细胞是下列属的成员：梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、志贺氏菌属(Shigella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、或糖酵母属(Saccharomyces)。在实施例中，所述重组宿主细胞是啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)。在实施例中，所述重组宿主细胞还包含编码多肽的异源性多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；以及(c)2，3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸。在实施例中，所述宿主细胞还包含编码多肽的异源性多核苷酸，所述多肽催化异丁醛至异丁醇的底物至产物转化。在实施例中，所述重组宿主细胞还包含降低的或消除的丙酮酸脱羧酶活性。在实施例中，所述重组宿主细胞还包含在编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变、和/或替换。在实施例中，所述重组宿主细胞包含fra2的缺失。在实施例中，所述重组宿主细胞还包含降低的或消除的甘油-3-磷酸脱氢酶活性。