[发明专利]NIK抑制剂基于细胞的筛选测定

权利要求书

1.用于鉴定抑制NIK活性的化合物的方法，其包括：

（a）提供在培养基中含有编码NIK的DNA和编码IKK1-KD的DNA的HEK细胞（经转染的HEK细胞）；

（b）在37℃ +/- 2℃的温度下在5% CO₂的存在下，使所述经转染的HEK细胞连同和不连同待测试的候选分子温育24小时；

（c）去除所述培养基；

（d）裂解所述细胞；

（e）将受体复合物随后将供体复合物加入所述细胞裂解产物中；

（f）用激光照射激发所述细胞裂解产物，和

（g）使用基于珠的发光接近检测系统，测量细胞裂解产物被激光激发后产生的信号，

其中得自细胞裂解产物的信号的减少或不存在指示NIK介导的IKK1-KD磷酸化的抑制，所述细胞裂解产物来源于在测试化合物的存在下培养的经转染的HEK细胞，并且其中所述受体复合物包含分子包被的珠和与所述IKK1-KD蛋白质结合的结合配偶体，并且所述供体复合物包含分子包被的珠和与所述IKK1-KD蛋白质结合的结合配偶体。

2.根据权利要求1的方法，其中与得自来源于在不存在测试化合物的情况下培养的经转染的HEK细胞的细胞裂解产物的信号相比较，得自来源于在测试化合物的存在下培养的经转染的HEK细胞的细胞裂解产物的信号的减少指示NIK介导的IKK1-KD磷酸化的减少。

3.根据权利要求1或2的方法，其中通过用含有编码NIK的DNA的第一种表达载体和含有编码IKK1-KD的DNA的第二种表达载体转染HEK细胞，将编码NIK的DNA和编码IKK1-KD的DNA插入所述HEK细胞内。

4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述受体复合物的分子包被的珠是蛋白A包被的珠，并且所述受体复合物的结合配偶体是与IKK1-KD的Ser-176残基的磷酸化形式特异性结合的抗体。

5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述供体复合物的分子包被的珠是链霉抗生物素蛋白包被的珠，并且所述供体复合物的结合配偶体是与IKK1-KD结合的生物素化的抗体。

6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述基于珠的发光接近检测系统是AlphaScreen检测系统。

7.根据前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括在细胞毒性测定中测试显示NIK抑制活性的那些候选分子的步骤，从而允许区分具有与细胞毒性效应相关的NIK抑制剂活性的候选分子与具有不与细胞毒性效应相关的NIK抑制剂活性的候选分子。