[发明专利]NIK抑制剂基于细胞的筛选测定

说明书

发明领域

本发明涉及用于筛选和鉴定NIK蛋白质抑制剂的基于细胞的测定。

发明背景

转录因子的核因子κB（NF-κB）家族包含结构上相关蛋白质的集合，所述蛋白质参与多种生物学过程，包括免疫应答、炎症、细胞死亡和存活（Thu Y.M.和Richmond A. Cytokine & Growth Factor Rev 2010, 21:213-226）。

哺乳动物NF-κB家族包含五个成员，包括p65（也已知为RelA）、p50（也已知为NF-κB1）、p52（也已知为NF-κB2）、RelB和c-Rel，其通过与κB增强子结合形成能够调节多种下游基因靶的转录和表达的几种二聚复合物。典型形式的NF-κB由p50/p65异二聚体组成。只要此类复合物与κB蛋白质的抑制剂（IκBS）的成员特别是IκBα结合，它通常就以失活形式在细胞质中隔离（Sun S.C.，Cell Res 2011，21:71-85）。

目前已知控制NF-κB活化的两个主要途径即经典和非经典途径。众所周知的经典NF-κB途径通过广泛范围的细胞外刺激触发，所述细胞外刺激包括促炎细胞因子例如TNFα、IL-1β、IL-6和CD40L。这个途径一般通过κB激酶三聚复合物激酶（IKKα、-β和–γ）的抑制剂介导，所述κB激酶三聚复合物激酶使IκB成员磷酸化，依次又导致IκBS通过蛋白酶体的遍在蛋白化和完全降解，并且允许释放的RelA/p50异二聚体易位到细胞核内，以起始基因转录（Hayden M.S.等人，Cell 2008, 132:344-362；Vallabhapurapu S.等人，Annu Rev Immunol 2009, 27:693-733）。

除了众所周知的经典途径外，还存在非经典途径。这个可选NF-κB活化途径通过一组肿瘤坏死因子配体（TNFL）家族成员诱导，所述家族成员例如CD40配体（CD40L）、B细胞活化因子（BAFF）或淋巴毒素β受体（LTβR）的配体。实验证据暗示这个途径在调节许多生物学过程中是重要的，所述生物学过程例如次级淋巴器官发育、B细胞存活和成熟以及涉及适应性免疫的特异性趋化因子的诱导（Dejardin E., Biochem Pharmacol 2006, 72:1161-1179）。

这个途径涉及通过诱导p100前体蛋白质经由IKKα和NF-κB诱导激酶（NIK）蛋白质加工为成熟p52的RelB/p52复合物活化。两种激酶都使p100磷酸化，所述p100含有IκB样C末端部分且因此充当NF-κB抑制剂，导致p100蛋白质的部分蛋白酶解，以获得活性形式p52。p100的加工因此作用于生成p52且诱导RelB/p52异二聚体的核易位（Coope H.J.等人，EMBO J 2002, 15:5375-5385）。

使用显性失活突变体的过表达，将NIK首先鉴定为介导TNFα和IL-1受体下游的近端信号传递的激酶，并且NIK的激酶活性是这个过程所必需的（Malinin N.L.等人，Nature 1997, 385:540-544）。NIK还通过其他受体例如CD27、CD30、CD40、LTβR和BAFFR介导刺激。当过表达时，NIK导致NF-κB的活化，因此保护细胞不经历TNFα诱导的细胞凋亡。

NIK已证实与IKKα和IKKβ相互作用且活化IKKα和IKKβ。然而，NIK使IKKα磷酸化至比IKKβ更大的程度。因此，NIK充当负责多种细胞因子受体的近端信号传递的上游IKK复合物激酶。

IKKα（也已知为IKK1）是NIK的优先底物。NIK直接使IKKα在Ser-176上磷酸化，并且这个残基突变为丙氨酸阻止IKKα的NIK活化，因此破坏来自IL-1和TNFα刺激的信号（Ling L.等人，Proc Natl Acad Sci 1998, 95:3792-3797）。

从与IKKα的优先相互作用可以推断NIK是对于IKKα比对于IKKβ更重要的激酶，并且NIK仅是非经典途径所必需的。然而，取决于诱导物和细胞类型，NIK的确在经典和非经典NF-κB途径中都起作用。来自使用具有NIK敲除或具有天然存在的NIK缺损突变体、淋巴发育不全（aly/aly）的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的研究的数据支持这个观点（Shinkura R.等人，Nature Genetics 1999, 22:74-77）。