[发明专利]重组蛋白通过与PNGaseF共表达在活体内去糖基化

说明书

技术领域

此文件涉及用于在植物中以非糖基化形式产生重组蛋白的材料和方法。

背景技术

已经研究基于植物的表达作为一种产生重组医药蛋白的方法。此技术尤其可用于表达糖基化蛋白。举例来说，哺乳动物糖蛋白当在转基因植物中表达时有效糖基化。

然而，植物糖基化蛋白质的能力对基于植物的表达系统的有效性也存在重要限制。举例来说，一些真核生物(例如，疟原虫属(Plasmodium)寄生虫)缺少用于N-连接糖基化的机制。源自这些物种的蛋白质可含有多个当在植物中表达时可异常糖基化的潜在糖基化位点，此由于(例如)表位的不正确/改变的折叠或遮蔽而导致降低的功能性和免疫原性。实际上，碳水化合物的附着可强烈影响蛋白质的物理-化学性质，且因此可改变必需的生物学功能，例如蛋白质的免疫原性、特定活性和配体-受体相互作用。

异常N-糖基化对于许多治疗应用产生许多问题。举例来说，癌细胞经常以蛋白质N-糖基化异常增加为特征(米哈依(Mihai)等人，(2009)癌症研究(Cancer Res.)69：5673)。另外，细胞表面受体(包括整合素和钙粘素)的异常N-糖基化似乎与癌进展和转移中的变化相关联(果(Guo)等人，(2002)癌症研究62：6837-6845；帕特里奇(Partridge)等人，(2004)科学(Science)306：120-124；和伊佐治(Isaii)等人(2004)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)279：19747-19754)。而且，植物与哺乳动物的N-连接聚糖之间存在重要结构差异。举例来说，植物复合N-聚糖含有人类复合聚糖中不存在的β1，2-木糖和α1，3-岩藻糖残基。另外，应注意，由于不同的糖基化阶段，当在转基因植物中表达时可产生多种形式的重组蛋白，由此在蛋白质纯化期间分离这些形式产生额外的工作。

已经努力人源化在植物中表达的生物医药的N-连接糖基化和N-聚糖(巴克(Bakker)等人(见上文)；圣-捷雷-杜帕斯(Saint-Jore-Dupas)等人，(2007)生物技术趋势(Trends Biotechnol.)25(7)：317-323；弗雷(Frey)等人，(2009)植物生物技术杂志(Plant Biotechnol.J.)7(1)：33-48；松尾(Matsuo)和松村(Matsumura)(2011)植物生物技术杂志9(2)：264-281；伊东美咲(Misaki)等人，(2003)糖生物学(Glycobiol.)13(3)；199-205；帕劳克帕(Palacpac)等人，(1999)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)96(8)：4692-4697；斯特拉瑟(Strasser)等人，(2009)生物化学杂志284(31)：20479-20485；和维齐纳(Vézina)等人，(2009)植物生物技术杂志7(5)：442-455)。

然而，之前尚未在任何真核系统(包括在植物系统)中满意地实现蛋白质在活体内的酶去糖基化。举例来说，例如使用衣霉素(tunicamycin)阻断N-糖基化的策略在植物中导致蛋白质的不均匀表达(霍里(Hori)和艾尔宾(Elbein)(1981)植物生理学(Plant Physiol.)67：882-886；和弗兰克(Frank)等人，(2008)植物生理学148(3)：1354-1367)。

发明内容

此文件提供使用瞬时表达方法在植物细胞中产生去糖基化形式的蛋白质(例如，特别的候选疫苗或治疗性蛋白质)的材料和方法。使用这些方法产生的蛋白质对于其功能性和免疫原性来说可尤其有用。

此文件部分地基于研发在细胞中通过瞬时表达细菌性肽：N-糖苷酶F(PNGase F)与所关注的另一种多肽的组合在植物细胞中产生去糖基化蛋白的方法。之前还未在植物系统中表达细菌性PNGase F。如下文实例中所阐述，细菌性PNGase F是与多种重组蛋白(特别地，疟疾(malaria)候选疫苗Pfs48F1E、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)保护性抗原(PA)和对抗炭疽芽孢杆菌PA的抗体)在本塞姆氏烟草(Nbenthamiana)中瞬时共表达。细菌性PNGase F在活体内具有完全活性且成功地从靶标糖蛋白裂解N-连接的寡糖，获得所表达蛋白质的均匀性。