[发明专利]具有病毒感染增强性质的肽及其用途

说明书

本发明涉及肽及其功能性衍生物以及其用于提高病毒侵入靶细胞的转导效率的用途。

背景技术

基因治疗方法经常因靶细胞对重组病毒载体的低转导效率而受阻碍。逆转录病毒载体，尤其是基于人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)的慢病毒载体(LV)是有前途的用于基因治疗的运载体（vehicle）(D'Costa等人，2009)。这些载体目前在临床应用中用于治疗各种疾病，如免疫缺陷疾病、神经变性或神经性疾病、贫血、HIV感染。一些逆转录病毒载体的应用依赖于特异性靶细胞的离体转导，如表达CD34标志物的造血干/祖细胞（造血干细胞/造血祖细胞）。对使用重组慢病毒颗粒的限制因素是在生产重组慢病毒载体颗粒的过程中获得具有高感染滴度的能力。避免这种限制的一种方法是在纯化步骤中浓缩病毒上清(Rodrigues等人，2007)。然而，对于一些LV，很难建立纯化工序，这取决于用于假型病毒颗粒的包膜糖蛋白-如GALVTR-LV(具有融合到双嗜性鼠白血病病毒(MLV-A)包膜糖蛋白的胞质尾的长臂猿白血病病毒包膜糖蛋白的假型LV(Sandrin等人，2002))就是这种情况。因此，许多慢病毒载体制剂具有低滴度，并被限制了转导功效。另一个限制因素是慢病毒载体自身感染靶细胞的能力。多种包膜糖蛋白如VSV-G、RD114TR、GALVTR可用于假型慢病毒载体，并对靶细胞如CD34+细胞具有可变的感染性(Sandrin等人，2002)。避免这些限制的一种策略是添加辅助因子以优化转导工序，如阳离子聚合物(如聚凝胺)或纤连蛋白片段(如Retronectin)(Davis等人，2004；Pollok等人，1999)。美国专利No.7,759,467公开了利用逆转录病毒以增加造血细胞转导效率的方法，其包括在纤连蛋白或纤连蛋白片段存在的情况下感染细胞。然而，所提出的方法并不能令人完全满意，至少由于以下两个原因：首先，用于提高逆转录病毒效率的纤连蛋白片段存在显著的经济上的弊端，这是因为其通常含有约270或更多的氨基酸。此外，使用纤连蛋白或纤连蛋白片段需要将培养板包被并将病毒上清预装载到固定化的纤连蛋白片段上。这两个步骤是难以标准化的，并可能导致一定程度的依赖于所使用的纤连蛋白片段和病毒上清的浓度的靶细胞转导的饱和(Novelli等人，1999)。

有趣的是，最近人类精液中的称之为SEVI的天然阳离子肽被鉴定为强HIV-1感染性增强子(Munch等人，2007；Roan等人，2009)。这一家族的肽也公开在国际申请No.PCT/EP2007/050727中，该国际申请公开了促进细胞病毒感染的人前列腺酸性磷酸酶的240-290的氨基酸残基片段。

国际申请No.PCT/FR02/01772中公开了在pH7.4具有大于或等于2的绝对电荷的两亲阳离子肽，并且包含至少一种亲水部分，所述部分包括至少三个残基，其能够于pH值小于7.4时被质子化以转运核酸或蛋白到细胞内。此文献没有公开或暗示使用该类肽以提高病毒或病毒载体的转导效率。此外，这些两亲阳离子肽含有抗菌活性(Mason等人，2009)。

本发明的目的是提供用于提高病毒或病毒载体的转导效率的方法，如用于提高将基因导入靶细胞。由于肽在其生物可降解性质、其缩小的尺寸、表征和大规模生产的简易性方面是令人感兴趣的，已进行了大量研究来鉴定能替代纤连蛋白和SEVI肽的替代物。

发明内容

本发明人已发现，如权利要求中所定义的特定的肽具有在真核细胞中促进病毒转导效率的性质，特别是在人原代造血祖/干细胞中。

根据一个方面，本发明涉及LAH4肽或其功能性衍生物在促进病毒或病毒载体感染真核细胞中的用途。

根据另一个方面，本发明涉及一种用病毒或病毒载体感染真核细胞的方法，特别是一种体外或离体的方法，其包含在LAH4肽或其功能性衍生物存在的情况下，将细胞与病毒或病毒载体相接触。

根据另一个方面，本发明涉及一种用病毒载体增加基因转运到靶细胞中的效率的方法，特别是一种体内或离体的方法，其包含在LAH4肽或其功能性衍生物存在的情况下，将病毒载体与靶细胞相接触，以促进核酸序列(如基因、cDNA、siRNA、shRNA、允许产生反义寡核苷酸的序列)转运到靶细胞中。

根据另一个方面，本发明涉及一种诊断受试者中病毒感染的方法，其包括将受试者的样品与真核细胞和LAH4肽或其功能性衍生物进行孵育，以扩增包含于所述样品的任何病毒，并鉴定所扩增的病毒。

根据另一个方面，本发明涉及新的LAH4衍生肽。