[发明专利]用于化合物筛选的无细胞翻译系统和有关的用途

说明书

本发明提供了包含不超过约5%麦胚提取物的无细胞系统，其用于表达蛋白诸如病毒蛋白和病毒衣壳装配所需的蛋白，并提供了以与病毒衣壳类似的方式装配成多蛋白复合物的蛋白。进一步提供了使用包含不超过约5%麦胚提取物的无细胞系统表达以下蛋白的方法：诸如病毒蛋白，衣壳装配所需的蛋白，和以与病毒衣壳类似的方式装配成多蛋白复合物的蛋白。进一步提供了在包含不超过约5%麦胚提取物的无细胞系统中测定化合物的方法，所述化合物调控病毒蛋白、病毒衣壳装配和蛋白装配成多蛋白复合物，所述多蛋白复合物的分裂可以改善细菌性疾病、寄生物性疾病、代谢疾病、肿瘤学疾病、免疫学疾病或中枢神经系统疾病。

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年8月3日提交的美国临时申请号61/514,825的权益，其内容明确地通过引用整体并入本文用于所有目的。

关于在联邦资助的研究和开发下做出的发明权的声明

不适用

技术领域

本发明涉及用于无细胞翻译所用组合物中的麦胚提取物、使用包括麦胚提取物的组合物表达蛋白的方法、装配病毒衣壳的方法、和检测调控蛋白-蛋白相互作用（包括、但不限于病毒衣壳的装配）的化合物的方法。

背景技术

无细胞翻译系统利用细胞提取物来表达目标蛋白。在该范例中，将体外转录或分离的RNA模板与其它组分（即氨基酸）一起加入细胞提取物中，以实现蛋白合成。

麦胚提取物场被用于无细胞翻译反应，且最初由不同的研究人员进行了描述(例如，Roberts,B.E.和Paterson,B.M.(1973,PNAS70,第2330页))。麦胚提取物是合乎需要的，因为它支持原核RNA、真核RNA和病毒RNA的翻译。已经进一步证实，麦胚提取物可用于被设计成装配病毒衣壳的无细胞系统中(Lingappa等人.J Cell Bio125:99-111(1994);Lingappa等人.J Cell Bio136:567-581(1997);Singh等人.Virology279:257-270(2001);Zimmerman等人.Nature415:88-92(2002);Lingappa和Thielen,Methods Mol Biol.485:185-95(2009))。病毒衣壳是病毒的保护病毒基因组的蛋白壳，且它的装配是由宿主因子催化的过程，可以靶向该过程来开发抗病毒药物。

有效的蛋白表达需要适当的麦胚提取物浓度。已经一般地证实，对于稳健蛋白表达而言最佳的麦胚提取物浓度是总翻译混合物的约40-50%(Erikson和Blobel,MethodsEnzymology96:38-50(1983))。报道已经指出，为了适当的衣壳装配，最佳地使用占最终反应体积的20%的麦胚提取物(Lingappa和Thielen,Methods Mol Biol.485:185-95(2009))。

使用无细胞表达系统的抗病毒药开发过程的一个重要方面是，证实抗病毒调节剂类似物在无细胞系统中的有效性的相对比例与在细胞培养物中它们对病毒的活性类似。当前使用的无细胞系统没有表现出治疗剂在体外破坏衣壳装配的能力和这些治疗剂阻止病毒复制的能力之间的有用关联。因此，需要开发这样的无细胞系统：其具有在无细胞系统中实现对药物的最大灵敏度的组分水平和比例，并然后与在细胞培养物中对活病毒的效力相关联。

发明内容

非常令人惊奇地，现在已经发现，在其中将麦胚提取物浓度维持在约5%或低于约5%的无细胞系统会提供药物敏感性和在5%麦胚提取物的传染性病毒药物敏感性之间的显著更好的关联，在10%或20%几乎没有明显关联。本领域迄今为止尚未认识到麦胚提取物浓度和药物敏感性之间的联系，从而推荐使用高浓度的麦胚提取物来使蛋白合成最大化。因而，文献的应当在较高浓度(例如，20%或更高)使用麦胚提取物的教导不会产生为药物筛选提供如本发明提供的在5%麦胚或更低浓度观察到的最适灵敏度的无细胞系统。