[发明专利]用于评价细菌细胞壁完整性的方法

说明书

技术领域

本发明涵盖在生物技术产业领域内，并且主要涉及微生物学，其应用范围是在卫生部门（人类健康、动物健康、环境健康和基础健康）中。本发明涉及在作用于细菌细胞壁的抗生素的存在下评价存在于培养物中的细菌细胞壁的完整性的方法，从实用的角度出发，该方法允许快速地确定细菌是否对作用于细胞壁的抗生素敏感或耐受。

背景技术

关于微生物对抗微生物药剂的敏感性的研究是临床微生物学实验室最重要的职责之一。该研究通过敏感性测试或抗菌谱（antibiogram）进行，其主要目的是在实验室中评价微生物对一个或几个抗微生物药剂的响应（反应，response）。

一些在日常临床实践中最常用的方法包括（i）扩散法，如基于Bauer、Kirby等人工作的圆盘-培养皿抗菌素谱（disc-dish antibiogram）（Bauer A W,等人.Am.J.Clin.Pathol.1966,45:493-496）或ε-测试或E-测试法（AB Biodisk，瑞典），或（ii）稀释法，如琼脂稀释法或肉汤微量稀释法。通过比较扩散法与稀释法，后者在技术上更为复杂，而且几乎总是更加昂贵，特别是当使用商业微量稀释板时。液体培养基中的微量稀释法是常规临床微生物学实验室实践中最常用的方法。

在许多实验室中，商业板的使用是基于使用半自动的孵育-读数-判读（incubation-reading-interpretation）系统；这促进了它们的应用，但具有增加支出的缺点。一些公司已经在市场上推出板，其中培养基包含允许快速获取（少于8小时）结果的荧光指示剂。关于对作用于细菌壁的抗生素（如β-内酰胺类）的耐受性的快速测定，将可代谢的荧光化合物添加到培养基中（专利申请WO/1992/019763）。如果有机体在抗生素下生长，那么细菌的代谢作用导致荧光团的释放。如果有机体不生长，那么样品的荧光增加。

另一种可能性是使用颜色指示剂化合物如四唑，在对抗生素敏感的事件中，在添加电子载体如吩嗪硫酸甲酯后，其会引起颜色的变化。然而，仍然没有足够的数据来允许建议常规应用这种板。

几个商业公司也正在评价专家系统（软件），该专家系统促进所获得结果的临床解释；假设在未来广泛使用这样的系统是安全。在当今市场上几个系统是可获得的，MicroScan WalkAway、Vitek和Wider是最突出的系统。缺乏较多的使用荧光指示剂的临床经验时，如上面提到的扩散方法中，用于获得特定微生物对抗微生物剂的易感性的平均响应时间的范围在18和24小时之间。

最近，已指出利用双向电泳系统的可能性，其检测施用抗生素后细胞在电生理学方面的变化（Hoettges KF,Dale JW,HughesMP.Rapid determination of antibiotic resistance in E.coli using dielectrophoresis.Phys Med Biol2007;52:6001-6009）。

对于作用于细菌壁的抗生素如β-内酰胺类的另一个开发由通过特定基质检测由细胞释放到培养基中的细胞质酶的活性组成，如果该抗生素已被实施（effective）（欧洲专利EP0135023）。

BACcelr8r^TM是由Accelr8正在开发的平台，用于自动识别微生物并研究其对抗生素的耐受性。它不使用培养物，细菌的分离也不是必要的。它通过多个盒的方式工作，其中每个盒对应于一个样品。它使用具有由计算机、数字相机和分析软件控制的显微镜的自动化系统。泵在不同条件下维持含细菌的培养基经过盒的流。可在8小时内完成抗生素耐受性分析。

专利申请US2004/0014066描述了用于检测样品中影响细胞完整性的抗生素活性的方法，其包括（a）提供包含编码启动子的核酸的转化的微生物，该核酸被可操作地连接到能够发出可检测信号的异源报告基因，并且（b）使样品与转化的微生物接触，（c）观察所述微生物的所述可检测信号，其中该启动子由双组分信号转导系统调控，其中所述组分为（i）对微生物的细胞被膜或细胞膜的变化敏感的受体及（ii）反式作用因子，其响应于受体引起的刺激而激活并调控启动子。

作用于细菌壁的抗生素