[发明专利]纯化裂解的胰岛素原的方法

说明书

发明领域

本发明属于生物分子纯化领域。更确切地讲，本发明涉及使用特定种类的具有内核和外部功能化层的壳珠的色谱纯化胰岛素。所述方法能够以超过90%的非常高的纯度纯化。

发明背景

胰岛素在细菌(E.coli)或酵母中生成。在细菌的情况下，胰岛素(表达为胰岛素原)在内含体中生成，经过变性、重折叠和复性之后通过几个步骤进行纯化。通常，几个色谱步骤与过滤步骤、胰岛素原酶促裂解成胰岛素、沉淀结晶和配制步骤结合。在酵母表达体系的情况下，不形成内含体，除此之外，该过程与细菌的情况十分类似。

胰岛素以每年数吨的产量被制造，且胰岛素的使用逐年增加。越来越多的人将患糖尿病，在发展中国家同样重要。胰岛素的需求增加使得必需利用有效的制造方法和工艺。产率日益重要且获得较高产率的方法通常给出较好的工艺经济性，转变成更实惠的产品。承受能力是制造可为更广泛基数的患者所用的产品的关键参数。这对于不断饱受成本增加压力的卫生保健部门施加不必要的约束同样重要。

因此，将期望具有以高产率获得纯产物的用于制造胰岛素的更快更经济的方法。

以前并没有提出使用壳珠色谱纯化胰岛素。

发明概述

本发明提供胰岛素纯化方法，其中，与常规方法相比较，色谱介质的荷载(每毫升色谱介质荷载的产物克数)可增加三倍，降低了色谱介质的消耗。这可直接转变成更加成本有效的方法。另外，在本文所述的色谱步骤中使用壳珠的方法可以较高的速度操作，使得能够在给定的时间生成更多产物，即通过缩短该特定色谱步骤的时间而使得该方法更加经济。

本发明提供使用壳珠用于生物分子纯化的方法，所述壳珠的特征在于仅在所述珠的最外层中功能化，即功能配体仅存在于所述最外层内，而不存在于所述珠的核中。可控制所述功能化层的厚度，且所述珠的未功能化的核可用例如葡聚糖填充或可以是空的。

具有功能化层的色谱珠具有的潜能是，具有与小得多的完全功能化的珠相当的分离度，同时维持较大珠的较好的压力流动性质。所述壳珠的容量(capacity)本质上将由功能化的珠的体积分数所反映，因此将低于同样大小的完全功能化珠的容量。

因此，本发明涉及由胰岛素原纯化胰岛素的方法，所述方法包括将裂解的胰岛素原样品装载到包含多孔壳珠的色谱介质上，所述壳珠具有内核和提供有离子交换配体的外部功能化层；将胰岛素吸附在所述配体上；和以100-1000cm/h、优选300-600cm/h的流速从所述色谱介质上洗脱胰岛素，其中所述洗脱的胰岛素具有大于85%、优选大于90%的纯度。

在所述方法中使用的壳珠的直径为20-100μm，优选为40-80μm。

所述壳珠的功能化层包括3-9μm厚的层，优选为5-7μm厚的层。

所述离子交换配体为强阳离子交换基团，诸如磺酸基(SO₃^-)、硫酸基(-OSO₃^-)、磷酸基(-OPO₃^2-)和膦酸基(PO₃^2-)。

在一个实施方案中，所述壳珠的核填充有合适的极性聚合物，以使得所得核更致密，从而给出较好的分离度(窄峰)。所述极性聚合物可为琼脂糖、葡聚糖、纤维素、淀粉、支链淀粉或完全合成的聚合物，如聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚(丙烯酸羟基烷基酯)。

附图简述

图1为在本发明的纯化方法中使用的壳珠的示意图。

图2为显示使用壳珠色谱法纯化胰岛素的图。

图3为床高和流速对在充填了两种不同介质的管柱上的背压的影响。

图4为使用商品介质和在本发明中使用壳珠介质纯化胰岛素的比较。

图5显示流速对商品介质和在本发明中使用的壳珠介质的影响。

图6显示商品介质和壳珠介质的胰岛素纯化的结果。

发明详述

下文将更密切地结合一些非限制性实施例描述本发明。

材料和方法

在本文中提供基于Sepharose HFA 55和两种参比原型/树脂的三种不同壳珠构建体的结果(图1，表1)。