[发明专利]重组人NAGLU蛋白质及其用途

说明书

相关申请的交叉引用

本申请涉及2011年10月12日提交的美国临时申请序列号61/546,248并且要求其优先权，其全部内容通过引用明确并入本文。

发明背景

桑菲列浦氏综合征B型(Sanfilippo Syndrome B)是由称为N-乙酰基-α-D-氨基葡萄糖苷酶(NaGlu)的溶酶体酶缺乏引起的常染色体隐性溶酶体贮积病(LSD)。作为溶酶体中糖胺聚糖(GAG)的逐步分解的一部分，降解硫酸乙酰肝素需要NaGlu。缺乏或没有NaGlu导致硫酸乙酰肝素的积累和尿排泄。迄今为止鉴定了超过70种不同突变，桑菲列浦氏综合征B型表现出广泛的分子和遗传异质性。

大约200,000个产儿中有1个患有桑菲列浦氏综合征B型并且缺乏症主要在幼儿中出现。在最初的无症状期后，患有桑菲列浦氏综合征B型的患者通常出现心理发展迟缓和行为问题，接着是智力逐渐下降，导致严重智力低下、痴呆和运动疾病。语言习得缓慢并且不完整。深受影响的患者可能早在2岁时就呈现精神运动和语言发展延迟。所述疾病通常发展为增加行为障碍和睡眠障碍。虽然临床特征主要是神经学上的，但是患者往往发展腹泻、龋齿、肝脾增大、关节强硬、脱发(hirsteness)和/或毛发粗糙并且可能表现出凝血问题。在疾病的最后阶段，患者变得不能移动和反应迟钝并且发展吞咽困难和癫痫。患病儿童的寿命通常不会超过少年晚期到二十岁出头。

已经尝试了不同方法在患者中提供缺失的酶。为生成供酶替代疗法(ERT)的NaGlu，已经在各种哺乳动物细胞培养系统中表达了人NaGlu。然而，与细胞内天然存在的运输到溶酶体的NaGlu相反，发现由哺乳动物细胞生成和分泌的重组NaGlu蛋白质不含或仅含微量的甘露糖6-磷酸(M6P)。已知分泌的NaGlu中M6P部分缺少或不足会妨碍其有效内化到在其质膜表面有M6P受体的靶细胞(例如，人皮肤成纤维细胞)中(见，Zhao等，Protein Expression and Purification,19:202-211(2000)；和Weber等，Protein Expression and Purification,21:251-259(2001))。在CHO细胞中表达的分泌型小鼠NaGlu、HeLa细胞中表达的分泌型人NaGlu、人成纤维细胞中表达的分泌型人NaGlu和人胚肾(HEK)细胞系293中表达的分泌型人NaGlu中看到低程度的磷酸化(见，Zhao等，Protein Expression and Purification,19:202-211(2000)；Yogalingam等，Biochim Biophys.Acta1502:415-425；和Weber等，Protein Expression and Purification,21:251-259(2001))。从哺乳动物细胞分泌的NaGlu蛋白质中N-聚糖没有磷酸化或弱磷酸化对开发适合酶替代疗法的重组人NaGlu蛋白质造成了一个主要障碍，因为前述所有尝试均未能生成被靶细胞有效吸收的酶，因为如果完全可检测，内化蛋白质的浓度比野生型水平低近一千倍(见，Zhao等，Protein Expression and Purification,19:202-211(2000))。迄今为止，没有经批准的产品可用于桑菲列浦氏综合征B型的治疗。

已经尝试直接向NaGlu缺乏的小鼠的中枢神经系统(CNS)施用(例如，向脑脊髓液(CSF)鞘内施用)哺乳动物细胞生成的具有天然氨基酸序列的重组人NaGlu蛋白质(rhNaGlu)，但是由于所述蛋白质在脑室室管膜衬里上过量积累以及缺乏有效细胞摄取的必需M6P残基，未能证明酶向脑部的成功生物分布。类似地，全身施用(即，静脉内(IV)注射)哺乳动物细胞生成的具有天然氨基酸序列的rhNaGlu也未能证明所述蛋白质向脑部的成功定位。除已知与高度侵入性鞘内施用相关的风险外，将rhNaGlu靶向脑部的这些障碍已经是获得用于治疗桑菲列浦氏综合征B型的有效疗法的太大挑战。

因此，需要提供具酶活性并且具有允许蛋白质穿过血脑屏障(BBB)和允许蛋白质有效内化到靶细胞的溶酶体中的物理性质的稳定NaGlu蛋白质。还需要可提供有效穿过血脑屏障并有效内化到人靶细胞中的重组人NaGlu的高表达且稳健的蛋白质产生平台。

发明概述