[发明专利]使用从酸预处理获得的碳底物由丝状真菌连续生产纤维素酶的方法

说明书

发明领域

本发明涉及生产纤维素酶和半纤维素酶，特别是在从木质纤维素材料生产乙醇的背景下生产纤维素酶和半纤维素酶。特别地，本发明涉及从丝状真菌开始连续生产纤维素酶的方法。

现有技术

开发用于生产第二代生物燃料的经济上可行的方法目前是一个“热点”。这些燃料从木质纤维素生物量生产，并且与从甘蔗、玉米、小麦或甜菜生产的“第一代”生物燃料相比，在关于与用于食物的农业用地的使用竞争方面产生更少的问题。

木质纤维素生物量的特征在于由三个主要级分组成的复杂结构：纤维素、半纤维素和木质素。将其转化成乙醇的常规方法包括一些步骤。预处理可以使纤维素能与酶，即纤维素酶接触。酶水解步骤可以用于将纤维素转化成葡萄糖，其然后在发酵步骤过程中转化成乙醇，所述发酵通常使用酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。最后，蒸馏步骤可以从发酵液(fermentation must)中分离并回收乙醇。

各种技术-经济的研究已证明，减少纤维素酶的成本是在从木质纤维素物质开始的生物乙醇生产方法中的关键点之一。目前，工业纤维素酶主要是由丝状真菌，里氏木霉(Trichoderma reesei)生产，因为其具有高纤维素酶分泌能力。

里氏木霉是最广泛用于生产纤维素酶的微生物。野生型菌株具有分泌纤维素(例如，在诱导物底物存在的情况下)的能力，考虑中的酶鸡尾酒（cocktail）对于纤维素的水解是最合适的。酶鸡尾酒的酶类包含三种主要活性类型：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和纤维二糖酶。具有对木质纤维素材料的水解至关重要的性质的其它蛋白也由里氏木霉产生，例如木聚糖酶。诱导物底物的存在对纤维素分解和/或半纤维素分解酶的表达是至关重要的。

对针对各种碳源的纤维素酶基因的调控已经进行了详细研究。它们在纤维素、其水解产物(例如：纤维二糖)或某些低聚糖，诸如乳糖或槐糖存在的情况下被诱导(IImén 等人，1997; Appl Environ Microbiol 63: 1298-1306)。

常规突变基因技术已经能够选择高产纤维素酶的里氏木霉菌株，诸如株MCG77(Gallo -专利US 4 275 167)、MCG80(Allen, A.L.和Andreotti, R.E., Biotechnol- Bioengi 1982, 12, 451-459 1982)、RUT C30(Montenecourt, B.S. 和Eveleigh, D.E., Appl Environ Microbiol 1977, 34, 777-782)和CL847(Durand等人, 1984, Proc Colloque SFM Génétique des microorganismes industriels [Genetics of industrial microorganisms]. Paris. H. HESLOT Ed, pp 39-50)。

从工业规模放大的观点来看，里氏木霉生产纤维素酶的方法已经是非常多的改进的目标。工业上采用的策略是在被称为真菌的生长阶段的步骤中使所述真菌快速生长至给定浓度，然后从所述真菌开始诱导生产纤维素酶，以便在被称为生产阶段的步骤中最大限度地提高生产率和产率。所述生长阶段通常在封闭的反应器中(即，以分批模式)实施。所述生产阶段通常在连续补料的反应器中实施，该期间不从反应器内容物中取出任何物质，即，它是分批补料模式。

为了获得良好的酶的生产率，有必要提供可以被快速吸收用于里氏木霉在生长阶段生长的碳源，和在生产阶段允许纤维素酶表达并在培养基中分泌的诱导物底物。纤维素可以起双重作用；然而，它在工业规模上难以使用，并已经被可用于表达纤维素酶的可溶性碳源诸如乳糖所替代。也已经描述了作为诱导物底物的其它可溶性糖诸如纤维二糖或槐糖，但是它们太昂贵而不能在工业规模上使用。然而，里氏木霉使用可溶性底物的纤维素酶生产远不如以分批模式基于纤维素所获得的生产率。这是由于糖的阻遏作用在高浓度可以很容易被吸收。

在分批补料模式中连续供给可溶性碳质诱导物底物意味着，通过限制培养物中的碳质底物的残留浓度并通过优化糖的数量已经能够解除代谢阻遏，以便获得更好的产率和更好的酶生产率。作为实例，专利FR-B-2 881 753描述了生产纤维素酶的方法，包括两个步骤：

· “分批”模式的生长阶段，其中供给可快速吸收用于里氏木酶生长的碳源是必需的，然后