[发明专利]核酸扩增方法、核酸基板、核酸分析方法及核酸分析装置

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸的碱基序列解析中使用的核酸扩增方法、核酸基板及核酸分析装置。

背景技术

正在陆续开发确定DNA、RNA的碱基序列的新技术。以前，碱基序列的确定采用利用了电泳的方法，预先调制序列确定用DNA片段或根据RNA试样进行反转录反应合成的cDNA片段试样，采用周知的桑格法(Sanger method)实施双脱氧反应后，进行电泳，测定分子量迁移展开谱图(pattern)并进行解析。

对此，近年来开发出将大量作为试样的DNA片段固定在基板上，并行确定大量片段的序列信息的方法，使碱基解析速度得到了飞跃性提高。这些技术中，将扩增作为解析对象的核酸序列得到的束(簇)配置在平面上，使用二维图像传感器进行测定，从而平行解析多个样品。例如，非专利文献1中，通过使用固定在基板上的引物在基板上进行PCR反应，从而在基板上形成扩增基因片段的簇。此外，非专利文献2中，进行乳液PCR，在微粒表面对核酸序列进行扩增和固定，并将该微粒固定在基板上，使多个样品配置在平面上。

在这些超并联型测序仪中，簇的形成是重要步骤，以高密度形成簇增加可以通过图像传感器一次获取的序列信息，提高每簇的扩增基因片段数可以提高序列信息的信号强度，提高序列信息的可靠性，同时实现检测装置的简化。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特表2002-525125号公报

专利文献2:日本特表2011-520420号公报

非专利文献

非专利文献1:Nucleic Acids Research,2000,vol.28,No.20,e87.

非专利文献2:Science2005,vol.309,pp.1728-1732.

非专利文献3:Nano Letter2010,vol.10,pp.788-792.

非专利文献4:P.N.A.S.2006,vol.103,pp.19635-19640.

发明内容

发明要解决的问题

超并联型测序仪中，通过二维图像传感器获取由配置在平面上的扩增基因簇产生的荧光或者发光反应，得到各基因片段的序列信息。因此，随着扩增基因簇的密度的提高，则从一张图像得到的序列信息量增加，有望实现高通量。

关于在基板上通过扩增反应制作多个簇的现有方法，例如专利文献1中公开的那样，将作为模板的试样DNA随机地散布在基板上，以预先固定在基板上的引物作为反应起点进行扩增反应。这种随机散布模板DNA的方法中，如果想提高簇密度，则供给至一定面积的区划内的模板DNA相对于分子数的频率分布为泊松分布，所以仅供给一分子模板DNA的区划的极限是最大约37％。因此，例如，以向基板上平均500nm见方的区划供给各一分子为目标，理想状态下应该能够获得400万个/mm²的簇密度，但即使对模板DNA浓度进行最适化，也仅能获得为其约1/3的130万个/mm²的簇密度这样的极限。也就是说，残留的问题是，如果将作为模板的试样DNA以高浓度固定，则模板DNA会紧挨着被固定在基板上，因此多种DNA会在同一区划内被扩增，无法进行正确的碱基序列解析；另一方面，如果将试样DNA以低浓度固定，则簇密度会下降，通量会下降。

专利文献2中还公开了一种方法，其在进行扩增反应后，将其扩增产物固定在预先形成于基板上的固定用垫上。但是，在该方法中，扩增反应为滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)反应，难以实现超过10,000倍那样的高扩增倍率。为了以高通量进行解析，不得不高速检测荧光亮点，并优选每簇的DNA片段数也多，但从DNA合成反应速度方面考虑，仅凭实用的数小时的反应时间的RCA反应，难以实现超过10,000倍的高扩增倍率。

本发明提供一种扩增方法，其与根据泊松分布的比例而设定的簇密度相比，实现了更高的簇密度，同时将各簇内的DNA片段数扩增至可以容易检测的10,000分子以上。

用于解决问题的手段

本发明的发明人等进行深入研究的结果，开发出一种扩增方法，其兼顾了与根据泊松分布求得的簇密度相比更高的簇密度、以及使簇内的DNA片段数为10,000分子以上的高扩增率。

特别是开发出了一种核酸扩增方法，当把500nm见方作为簇的一个区划时，其簇密度与根据泊松分布求得的簇密度130万个/mm²相比更高，且将簇内的DNA片段数扩增至10,000分子以上。