[发明专利]使用了重组酵母的乙醇的制造方法

说明书

技术领域

本发明涉及使用了具有木糖代谢能力的重组酵母的乙醇的制造方法。

背景技术

纤维素系生物质作为乙醇等有用醇和/或有机酸的原料而被有效利用。为了在利用了纤维素系生物质的乙醇制造中提高乙醇生产量，开发了作为底物能够利用5碳单糖木糖的酵母。例如，专利文献1公开了染色体中插入了来源于树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因以及来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)的木酮糖激酶基因的酵母。

另外，已知乙酸在纤维素系生物质的水解物中大量含有，抑制酵母的乙醇发酵。特别地，已知在导入了木糖的同化基因的酵母中，显著地抑制以木糖为糖源的乙醇发酵(非专利文献1和2)

另一方面，将用纤维素酶糖化纤维素系生物质而得的物质进行发酵后的醪中，主要包含未发酵残渣、难发酵残渣、酶和发酵用微生物。通过将包含醪的反应液在接着进行的发酵中利用，可以实现发酵用微生物的再利用，降低发酵用微生物的新加入量，实现低成本化。但是，此时，醪所含的乙酸也同时被带入，其结果是有时发酵培养基所含的乙酸的浓度上升，抑制乙醇发酵。另外，即使在将发酵槽内的醪送入保持减压的闪蒸罐，在闪蒸罐内除去乙醇后，将醪送回发酵槽这样的连续发酵法中，也难以从醪中去除乙酸，因而由乙酸产生的发酵抑制成为重要的问题。

为了避免由乙酸产生的发酵抑制，有通过乙醇发酵中一般使用的菌株酿酒酵母的LPP1基因和/或ENA1基因的过表达(非专利文献3)、FPS1基因的破坏(非专利文献4)来改善在乙酸存在下乙醇的发酵能力的报告。然而，这些报告是以葡萄糖作为底物时的乙醇发酵的结果，对由于乙酸而发酵被显著抑制的以木糖作为底物时的乙醇发酵的效果不明。另外，即使使用这些报告的突变酵母，也不能实现减少在如上所述的发酵菌体再利用和/或连续发酵时成为问题的乙酸的带入量。

作为避免由乙酸产生的发酵抑制的其他方法，考虑使培养基中的乙酸在乙醇发酵的同时代谢。但是，乙酸的代谢是需氧的反应，与乙醇的代谢途径重复。因此，虽然如果在需氧条件下进行发酵则可能使乙酸代谢，但同时目的物质乙醇也被代谢。

为了在乙醇不被代谢的厌氧条件下使乙酸代谢，有通过在破坏了酿酒酵母的甘油生产途径的GPD1·GPD2基因的株中导入编码乙醛脱氢酶(EC1.2.1.10)的mhpF基因，从而同化乙酸的报告(非专利文献5、专利文献2)。此外，乙醛脱氢酶催化以下的可逆反应。

乙醛+NAD^＋+辅酶A乙酰辅酶A+NADH+H⁺

此外，利用GPD1·GPD2基因的甘油生产途径如下述式所示，是将代谢中产生的剩余的辅酶NADH氧化成NAD^＋的途径。

0.5葡萄糖+NADH+H⁺+ATP→甘油+NAD⁺+ADP+Pi

于是通过破坏GPD1·GPD2基因来破坏该反应途径，通过导入mhpF来供给剩余的辅酶NADH，进行下述的反应。

乙酰辅酶A+NADH+H⁺→乙醛+NAD^＋+辅酶A

另外，乙酰辅酶A由乙酸通过乙酰辅酶A合成酶而合成，乙醛被转换成乙醇，因而最终形成下述反应式，在剩余的辅酶NADH被氧化的同时，乙酸也被代谢。

乙酸+2NADH+2H⁺+ATP→乙醇+NAD^＋+AMP+Pi

如上所述，对酵母赋予乙酸代谢能力的机理，需要破坏甘油途径。然而，已知GPD1基因和GPD2基因的重复破坏株发酵能力大幅降低，产业水平上的实用性低。另外，非专利文献5和专利文献2不是关于木糖同化酵母的报告，在木糖同化时是否有效果是不明的。

此外，还有对GPD1基因和GPD2基因的非破坏株导入mhpF基因的报告(非专利文献6)。然而，非专利文献6中虽然通过mhpF基因的导入而乙酸的生产量减少，但没有培养基中的乙酸减少这样的报告。进而，该非专利文献6也还不是关于木糖同化酵母的报告。