[发明专利]探针：反义探针组合物对高特异性DNA或RNA的检测

权利要求书

1.一种同时扩增和选择性地检测靶核苷酸序列的探针系统，所述系统包括至少一种探针:反义探针系统，其包括：

(a)包括与第一靶核苷酸序列互补的核苷酸序列的自由漂浮探针寡核苷酸，以及与其连接的第一标记部分；和

(b)自由漂浮反义探针寡核苷酸，其包括附着于其上的减少或调节第一标记部分的信号的第二标记部分并包括除了在非末端、非中间位置有意插入的至少一个不匹配的碱基外与所述探针寡核苷酸完全互补的核苷酸序列，

其中所述探针和反义探针被配置从而所述探针寡核苷酸和第一靶核苷酸序列的双链，以及所述探针寡核苷酸和反义探针寡核苷酸的双链，相差至少2千卡/摩尔的ΔG和至少4℃的Tm，从而该探针对第一靶核苷酸序列的在溶液中的亲和力高于该探针对所述反义探针寡核苷酸的在溶液中的亲和力，并且其中所述探针寡核苷酸和第二靶核苷酸序列的双链，以及所述探针寡核苷酸和第一靶核苷酸序列的双链，相差至少4千卡/摩尔的ΔG和至少8℃的Tm，从而该探针对所述反义探针的在溶液中的亲和力高于该探针寡核苷酸对第二靶核苷酸序列的在溶液中的亲和力，从而在溶液杂交条件下，所述探针寡核苷酸优先首先结合所述第一靶标，其次结合所述反义探针寡核苷酸，再次结合所述第二靶标，从而

(i)在第一靶核苷酸序列存在时，所述探针寡核苷酸和所述第一靶核苷酸序列在溶液中形成双链，由此所述第一和第二标记部分不发生相互作用，从而提供了指示靶标检测的第一可检测信号；

(ii)在所述第一靶核苷酸序列不存在时，该探针寡核苷酸和反义探针寡核苷酸在溶液中形成双链，其中所述第一和第二标记部分的确相互作用从而提供被减少或被调节的第二信号，其中所述第一信号和所述第二信号均是可检测的和可区分的；及

(iii)在与所述第一靶核苷酸序列相差至少一个碱基不匹配的第二靶核苷酸序列存在时，探针寡核苷酸和反义探针寡核苷酸优先在溶液中形成双链，由此抑制所述探针寡核苷酸与第二靶核苷酸序列形成双链，和由此避免所述第二靶核苷酸序列的错误检测。

2.如权利要求1所述的系统，其增加单碱基特异性，其中所述探针寡核苷酸序列被进一步配置有在以下位置的不匹配的碱基，该位置离所述第二靶核苷酸序列与所述探针序列之间预期的不匹配一个或两个碱基；由此，在探针寡核苷酸中的不匹配的碱基和在第二靶核苷酸序列中的不匹配的碱基产生探针寡核苷酸:第二靶核苷酸序列双链的内部两个或三个碱基的未杂交区域，所述双链从而具有的ΔG和Tm小于探针寡核苷酸:反义探针寡核苷酸双链的ΔG和Tm，以增加单碱基特异性。

3.如权利要求1所述的系统，其中一个标记部分是荧光发射器，并且另一个标记部分包含荧光调制器；其中所述荧光调制器选自由以下组成的组：淬灭剂化合物、第二较高波长的荧光化合物、金属颗粒以及富含鸟嘌呤的缀合物，其中所述探针寡核苷酸包含荧光发射器和/或荧光调制器，并且其中所述反义探针寡核苷酸包含荧光调制器和/或荧光发射器由此所述探针与所述反义探针的结合使得至少一个荧光发射器接近荧光调制器，由此减少信号。

4.如权利要求1所述的系统，其中所述反义探针寡核苷酸与Taqman或MolecularBeacon探针测定相结合；其中反义探针寡核苷酸包含荧光调制器，并包含部分互补于Taqman或Molecular Beacon探针的序列。

5.如权利要求1所述的探针系统，其选自由以下各项组成的组：

(i)iDDS探针系统，其中所述探针寡核苷酸的3'端和任选地反义探针寡核苷酸的3'端被阻断，以防止聚合酶延伸；并且其中所述系统还包括为扩增包含第一靶核苷酸序列的核酸区域而配置的一对侧翼引物；

(ii)Flip探针系统，其中所述反义探针寡核苷酸的3’末端任选地通过无碱基间隔区连接到第一引物寡核苷酸；和所述系统还包含第二引物寡核苷酸，其中所述第一和第二引物寡核苷酸被配置用于扩增包含所述第一靶核苷酸序列的核酸区；和

(iii)ZIPR探针系统，其中所述探针寡核苷酸包含引物序列并被配置为与引物寡核苷酸配合以扩增所述靶核苷酸序列，当所述探针寡核苷酸结合到扩增子时产生可检测信号。