[发明专利]探针：反义探针组合物对高特异性DNA或RNA的检测

说明书

相互作用并标记的多核苷酸探针和反义探针和/或互补的靶探针，为我们提供了用于扩增或检测核酸的组合物及方法。这些组分的竞争性热力相互作用导致显示靶频率的信号变化，并且可以提供促成单碱基识别错误的检查功能。这些探针、反探针组合物能进行实时荧光定量PCR检测，终点检测和微生物的微阵列检测，耐药突变和癌症相关的变异。一些探针、反义探针在两个引物之间作为内部探针，一些作为引物探针。采用两个探针：反义探针系统检测同一模板的不同方面，以辨别或量化一些靶序列。还提供了增强靶扩增和检测特定单碱基变异的系统。探针也可通过引入一个碱基不匹配以增加相差一个碱基的正确与不正确的靶的热力学识别力而修饰。

交叉引用的相关申请

本申请要求于2011年9月15日提交的第61/534,925号、名称为 “探针：反义探针组合物对高特异性DNA或RNA的检测”的美国临时专 利申请的优先权，它们的全部内容通过引用并入本文。

序列表

本发明包括其全部内容通过引用并入本文的一个序列表。

技术领域

本发明涉及核酸探针技术领域和特异性的鉴定以及定量DNA或 RNA序列的组合物和方法。本发明特别涉及基因扩增期间或扩增后靶向 基因的标记和检测。

背景技术

靶向多核苷酸序列的检测通常是基于使得标记DNA探针与感兴趣 的靶序列杂交的方法。为了有效地工作，该探针-靶杂交产物必须杂交后 进行洗涤以除去未结合的探针和被弱结合到非特异性靶的探针。然而， 在实时PCR(美国专利4,965,188；美国专利5,210,015；美国专利 5,487,972；美国专利5,538,848)的条件下，洗涤步骤是不可行的，因 此，必须设计出当它们被结合到匹配的靶上时选择性地生成信号或者当 它们未被结合并在溶液中自由漂浮时已减弱或淬火信号的新的探针。为 了达到这个目的，一直依赖于使用一个供体和受体分子间的荧光能量激 发和转移的探针，如两个荧光团之间或荧光团和淬灭剂([Didenko V，(2001)Biotechniques31：1106-1116，1118，1120-1121；Chen et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA30：94：10756-10762)。供体的荧光发 射光谱应该与受体的吸收或激发光谱重叠。当它们很靠近(10至100埃) 时，所述荧光供体分子的激发态能量然后被转移到受体分子上。然而， 如果受体分子是荧光信号本身有荧光性的，它提供了一个较长波长的发 射信号。如果受体分子是一种有效的淬灭剂，荧光信号会明显地减少， 而且可以基本上关闭。

TAQMAN.RTM和分子信标探针都属于这种实时PCR检测的常用 探针。在这两种情况下，它们是作为内部探针，其用于与一对感兴趣的 靶区域侧翼的相对的引物相结合。引物扩增靶片段，探针选择性地结合 到引物位点之间的识别序列，由此导致相对于靶频率增加的荧光信号的 增加。虽然这些检测系统实际上是相似的，但它们采用不同的检测机 制。

一种TAQMAN.RTM探针包含与靶序列互补的约20至30个碱基 的合成寡核苷酸，并且在相对的两端将其标记上荧光供体和受体(美国专 利5,538,848)。通常地，5′端具有更短波长的荧光团，例如荧光素，和 3′端标记有更长波长的发射荧光团(如TAMRA.RTM)或非荧光淬灭剂如 Black Hole Quencher.RTM。内部淬灭剂也被使用。而TAQMAN：RTM 专利已经过期，这项技术仍然是用于实时PCR的主要探针系统。

分子信标探针也可以使用荧光相互作用来检测和量化PCR产物， 每个探针通常具有5′荧光标记端和3′淬灭剂标记端(美国专利5,925,517； Tyagi et al.，(1996)Nat.Biotechnology14：303-308)。然而，分子信标 探针进一步包括约5至7个互补的碱基的小片段，并在溶液中结合在一 起，形成茎-环结构，其中所述淬灭剂和荧光团标记端都被放在一起，且 信号被抑制。