[发明专利]用于对抗体的糖基化进行测定的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于对抗体与存在于细胞表面上的可结晶片段Fc的受体(以下称为“Fc受体”或FcR)的结合进行检测的方法，并涉及用于对抗体的糖基化水平进行测定的方法。

背景技术

多年来，重组单克隆抗体使得得以发生治疗革命。虽然其临床效力不再需要任何证明，然而对于重组单克隆抗体在患者中的作用方式仍知之甚少。靶向膜抗原的抗体的疗效特别涉及募集表达抗体可结晶片段的受体(以下称为“Fc受体”)的效应细胞。

Fc受体是存在于对免疫系统的功能有贡献的特定细胞表面上的蛋白，所述细胞特别是NK(“自然杀伤”)细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞。Fc受体的名字来自于它们与抗体的Fc(可结晶片段)区域结合的能力。存在多种类型的Fc受体，根据Fc受体识别的抗体类型将其分类：Fcγ受体(FcγR)与IgG结合；Fcα受体(FcαR)与IgA结合；以及Fcε受体(FcεR)与IgE结合。

Fc受体与抗体的结合触发多种机制，这取决于表达该受体的细胞的性质。表1为不同Fc受体的细胞分布以及由该受体与抗体结合所触发的机制的概要。

表1

鉴于Fc受体与抗体结合的相关机制的重要性，在这些受体处于细胞环境中时、特别是在开发用于诊断或治疗目的的抗体或Fc片段的情况下，能够检测这一结合将是特别有利的。

触发ADCC机制的治疗性抗体目前已在销售，并适用于治疗某些癌症：这些抗体的Fc片段与存在于NK细胞上的Fc受体结合，而这些抗体的可变域识别存在于肿瘤细胞上的抗原(赫赛汀(Herceptin)：Her2；西妥昔单抗(Cetuximab)：Her1)。这些抗体同时与NK细胞和癌细胞的结合通过ADCC机制的活化显著导致癌细胞的破坏。

此外，已知抗体Fc片段的糖基化影响这些抗体对于FcR的亲和力，因此影响其募集效应细胞的能力。具体而言，在Fc片段的N-聚糖基团水平几乎不存在或不存在岩藻糖残基的改进的治疗性抗体在低浓度引起强ADCC应答，与其岩藻糖基化的等同物(equivalents)相比具有好得多的效力(Shields等，J Biol Chem.2002年7月26日，277(30)：26733-40；Suzuki等，Clin Cancer Res.2007年3月15日，13(6)：1875-82)。在这些研究中，通过ELISA(“酶联免疫吸附分析”的首字母缩略词)类型的分析或在功能上通过测量ADCC应答，对抗体与FcR的结合进行测量。

一般说来，用于检测潜在治疗性抗体与由完整(intact)细胞表达的Fc受体的结合的方法将是用于开发治疗性抗体或者用于研究由Fc受体介导的免疫系统机制的有价值的工具。目前可用于研究抗体与Fc受体的结合的技术相对繁琐(tedious)。

以这一名称销售的系统允许检测两个结合伴侣(partner)之间的相互作用，这一系统基于表面等离子共振现象。已将该系统用于研究抗体Fc片段的糖基化对其与FcγRIII受体的结合的影响。该系统需要将Fc受体或待测抗体的Fc域片段固定在微芯片上，以使其能够生成取决于其表面折射率的信号(Biacore Journal Number1，2009，15-17)。该方法具有数个缺陷，尤其是将结合伴侣之一固定在微芯片表面这一关键步骤，需要昂贵且满足一定专业水平的设备，并且事实上该技术不能用于对研究中表达Fc受体的活细胞进行操作。此外，这一方法还不能提供关于测试抗体可能以其细胞构象与抗原结合的信息。

法国专利申请FR2844521描述了一种方法，根据该方法，将抗体与表达CD16受体的细胞在该抗体的抗原存在的情况下接触，并测量由该细胞产生的至少一种细胞因子，细胞因子量的增加代表所述细胞的活化。该技术不能直接测量抗体与FcR的结合。该技术还需要对上清液进行离心的步骤来检测由细胞分泌的细胞因子。

欧洲专利申请EP1298219描述了用于对抗体Fc片段对表达FcR的细胞的影响进行测定的方法，该方法包括：将所述抗体固定在固体支持物上，在所述抗体存在的情况下培养表达所述受体的细胞，并测量在所述抗体存在的情况下对FcR的任何影响。在该方法中，也通过检测由细胞产生的细胞因子，对FcR的活化进行间接测量。该技术具有与申请FR2844521中所描述的技术相同的缺陷，尤其是离心步骤。