[发明专利]与工业制药应用相容的可放大的慢病毒载体生产系统

权利要求书

1.一种用于生产重组慢病毒载体的方法，其包括：

在无血清培养基中悬浮培养HEK293T细胞，所述HEK293T细胞转染有至少一种适合于生产慢病毒载体的质粒，所述培养在至少50L的体积中进行；

从培养基中收获所产生的重组慢病毒载体。

2.权利要求1的方法，其中将丁酸钠加入到培养基中。

3.权利要求1的方法，其中收获步骤由单次慢病毒收获组成。

4.权利要求3的方法，其中所述转染是瞬时转染，并且单次收获在转染后48至72小时之间实施。

5.权利要求1的方法，其包括转染步骤，其中用聚乙烯亚胺(PEI)和质粒的混合物转染细胞。

6.权利要求5的方法，其中所述PEI是20-25kD的线性PEI。

7.权利要求5的方法，其中利用至少1.5μg/10⁶个细胞的DNA总量进行转染。

8.权利要求5的方法，其中在转染前将PEI和质粒依照少于10的N/P比率混合，其中N/P是指每个寡核苷酸磷酸的PEI氮原子数目。

9.权利要求8的方法，其中所述N/P比率为6。

10.权利要求5的方法，其中在加入到细胞培养物中之前PEI和质粒之间的接触时间是在5至30分钟之间。

11.权利要求10的方法，其中在加入到细胞培养物中之前PEI和质粒之间的接触时间是10分钟。

12.权利要求1的方法，其中在细胞转染后24小时将丁酸钠加入到细胞培养物中而不更换培养基。

13.权利要求12的方法，其中丁酸钠以在培养物中2mM至12mM之间的终浓度加入到细胞培养物中。

14.权利要求13的方法，其中丁酸钠以在培养物中2mM至10mM之间的终浓度加入到细胞培养物中。

15.权利要求14的方法，其中丁酸钠以在培养物中5mM的终浓度加入到细胞培养物中。

16.权利要求1至15任一项的方法，其中用4种质粒转染细胞，所述4种质粒包括编码包膜蛋白的质粒(Env质粒)、编码慢病毒GagPol蛋白的质粒(Gag-Pol质粒)、编码慢病毒Rev蛋白的质粒(Rev质粒)以及在慢病毒3’-LTR和慢病毒5’LTR之间包含目标转基因(TOI)的质粒(TOI质粒)。

17.权利要求1至15任一项的方法，其中产生了至少10⁷个感染基因组/mL培养基。

18.权利要求1至15任一项的方法，其中：

利用PEI与所需质粒的混合物进行HEK293T细胞的转染；

在转染后24小时加入丁酸钠而不更换培养基；并且

对所产生的慢病毒载体进行单次收获。

19.一种细胞培养装置，其中所述培养装置含有至少5L体积的无血清培养基，所述培养基中包含转染有至少一种适合于生产慢病毒载体的质粒的HEK293T细胞，所述细胞在所述培养装置中悬浮生长。

20.一种通过在无血清培养基中悬浮生长的HEK293T细胞而对慢病毒载体的生产进行优化的方法，所述HEK293T细胞转染有所述生产所需的质粒，所述方法包括在转染后24小时将丁酸钠加入到HEK293T细胞培养物中而不更换培养基。

21.权利要求20的方法，其中所述丁酸钠以5mM的终浓度加入。