[发明专利]与工业制药应用相容的可放大的慢病毒载体生产系统

说明书

本发明涉及重组慢病毒载体生产的工业化，以便制造用于治疗性应用例如基因疗法和/或DNA疫苗接种的足够的材料，以用于临床试验和/或商业用途。

本发明涉及重组慢病毒载体生产的工业化，以便制造用于治疗性应用例如基因疗法和/或DNA疫苗接种的足够的材料，以用于临床试验和/或商业用途。

技术领域

重组病毒载体用于基因疗法和DNA疫苗接种应用的用途的进步产生了大规模制造临床级病毒载体以转移遗传物质的需要。一种这样的病毒载体家族是属于逆转录病毒科的慢病毒属。

用于基因疗法应用的慢病毒载体常规是利用慢病毒构建物DNA系统通过磷酸钙转染贴壁细胞而制造的，所述转染需要培养基中有胎牛血清(Merten等，2011，Hum GeneTher.22(3)：343-56)。培养物中存在这种动物来源的组分构成了安全性风险，限制了该方法的GMP合规性。此外，这种生产方法就扩大规模而言严重受限，并且不适用于基因疗法的治疗、商业和/或工业应用所要求的生产大量载体粒子。例如，现有的常规方法允许在纯化前在一次运行中产生24至48L慢病毒载体悬液，其滴度为约1×10⁷至3×10⁷个功能性载体粒子/mL，在20％的标准纯化产率下，这会在终产物中产生最多3×10¹¹个粒子。相比而言，I期临床试验需要至少5×10¹¹个功能性慢病毒载体粒子(McGregor等，2001，Hum Gene Ther.，12：2028-2029)。因此，现今强烈需要工业化慢病毒载体生物制造方法，其将满足当每个患者需要大量载体或者必须对大量患者进行治疗时对于足够量的治疗性载体的需要，或者更通常地对将成本保持在合理水平并且维持优良制造规范(good manufacturing practice)(GMP)的合规性的需要。

改进的一个潜在途径是使用在不存在胎牛血清(FBS)的化学条件培养基中悬浮生长的细胞培养物，以克服与使用FBS有关的安全性风险以及对导致常规方法缺乏可放大性的主要原因的细胞培养容器的需要。例如，最近已经描述了在不存在血清的悬浮培养物中通过瞬时转染来生产病毒载体。具体地，Ansorge等已经提出了在灌注培养物中通过瞬时转染悬浮生长的HEK293SF-3F6细胞来生产慢病毒的方法(Ansorge等，2009，J Gene Med，11：868-876)。然而，所提出的方法既复杂，又在规模上受限。事实上，Ansorge等的方法是在灌注培养物中进行的，这需要数个收获步骤以及复杂的控制措施。此外，那项研究中提出的生产局限于3升的体积。Segura等也已提出通过瞬时转染悬浮培养物来生产慢病毒载体的方法(Segura等，2007，Biotechnology and Bioengineering，98(4)：789-799)。尽管如此，所提出的方法是复杂的，因为其需要数个收获步骤以及在转染后第3、4和5天更换全部培养基以及复杂的控制措施对照测量。此外，病毒载体的生产局限于3升的体积，而且据报道，仅仅是重组蛋白的生产，而非病毒载体的生产已经被放大至60L规模。因此，尽管存在这些报道，仍然需要开发用于从悬浮细胞培养物生产慢病毒载体的简单明了的工业化方法，其能同时解决商业规模的基于慢病毒的疫苗和/或基因疗法产品所面对的数量和质量问题。本发明通过公开一种能够提高病毒产量的优化的细胞培养物和慢病毒生产方法，解决并满足了这些需要。

发明内容

本发明涉及制药级重组慢病毒载体的工业化规模生产方法。下面显示的结果表明，发明人已经能够提供一种在产量和质量方面与利用贴壁细胞的现有GMP生产方法一样好或者更好、但具有大得多的放大生产潜能的方法。

因此，在第一个方面，本发明涉及用于生产重组慢病毒载体、慢病毒和假病毒的方法，其包括：

-在无血清培养基中悬浮培养哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞转染有至少一种适合于生产慢病毒载体的质粒，所述培养在至少5L的体积中进行；

-从培养基中收获所产生的重组慢病毒载体。