[发明专利]用高同源性寡核苷酸抑制非特异性扩增

权利要求书

1.用于在核酸扩增反应中使用的抑制寡核苷酸，其具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列。

2.权利要求1的抑制寡核苷酸，其中所述至少一个同源性区域为至少15个碱基对长。

3.权利要求1或2中任一项的抑制寡核苷酸，其中所述至少一个同源性区域跨越所述抑制寡核苷酸的3’-末端。

4.权利要求3的抑制寡核苷酸，其中所述跨越所述抑制寡核苷酸的3’-末端的至少一个同源性区域在从3'-末端的4个核苷酸内含有不超过2个错配。

5.权利要求1-4中任一项的抑制寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NOs:1-5的核酸序列。

6.设计用于在核酸扩增反应中使用的抑制寡核苷酸的方法，其包括使用序列比对算法来选择具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列的寡核苷酸。

7.权利要求6的方法，其中所述至少一个同源性区域具有以下特性中的一个或多个：为至少15个碱基对长；跨越抑制寡核苷酸的3'-末端；从3'-末端的4个核苷酸内含有不超过2个错配。

8.权利要求6或7中任一项的方法，进一步包括：

(a)鉴定一个或多个目标区域；

(b)对于每个目标区域，使用所述目标区域作为查询进行所述目标基因组序列的搜索来鉴定所述目标区域和所述目标基因组之间的同源性区域；

(c)选择在所述目标基因组中具有最多同源性区域的目标区域的区段；

(d)在步骤(c)中选择的区段中设计一个或多个寡核苷酸；

(e)用步骤(d)中设计的寡核苷酸进行目标基因组的搜索，以鉴定符合以下标准中的一个或两个的与所述目标基因组具有最高同源性区域数目的寡核苷酸：至少75％同一性，所述寡核苷酸的3'-末端区域的4个核苷酸中存在不超过2个错配；

(f)任选地，用步骤(d)中设计的寡核苷酸进行所述目标基因组的搜索，以鉴定和排除具有位于所述目标基因组的相对链上至少两个同源性区域的寡核苷酸，所述同源性区域在所述寡核苷酸和所述目标基因组序列之间具有至少75％同一性，其中所述同源性区域被少于约1000个碱基对隔开。

9.降低核酸扩增反应中非目标核酸模板的扩增的方法，其包括在具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列的抑制寡核苷酸存在的情况下进行扩增反应。

10.权利要求9的方法，其中所述至少一个同源性区域具有以下特性中的一个或多个：为至少15个碱基对长；跨越抑制寡核苷酸的3'-末端；从3'-末端的4个核苷酸内含有不超过2个错配。

11.权利要求9或10中任一项的方法，其中所述抑制寡核苷酸包含选自SEQ ID NOs:1-5的核酸序列。

12.用于进行具有减少的非目标序列扩增的扩增反应的试剂盒，其包括具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列的抑制寡核苷酸。

13.权利要求12的试剂盒，进一步包含以下中的一种或多种：等位基因特异性引物、通用引物、探针、三磷酸核苷、核酸聚合酶和对于聚合酶的功能所必需的缓冲剂。

14.权利要求12或13中任一项的试剂盒，其中所述至少一个同源性区域具有以下特性中的一个或多个：为至少15个碱基对长；跨越抑制寡核苷酸的3'-末端；从3'-末端的4个核苷酸内含有不超过2个错配。

15.用于进行具有减少的非目标序列扩增的扩增反应的反应混合物，其包括具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列的抑制寡核苷酸。

16.权利要求15的反应混合物，进一步包含以下中的一种或多种：等位基因特异性引物、通用引物、探针、三磷酸核苷、核酸聚合酶和对于聚合酶的功能所必需的缓冲剂。

17.权利要求15或16中任一项的反应混合物，其中所述至少一个同源性区域具有以下特性中的一个或多个：为至少15个碱基对长；跨越抑制寡核苷酸的3'-末端；从3'-末端的4个核苷酸内含有不超过2个错配。