[发明专利]用高同源性寡核苷酸抑制非特异性扩增

说明书

发明背景

聚合酶链式反应(PCR)扩增核酸在生物医学研究、诊断和生物技术中有许多应用。PCR的独特特异性能够实现在压倒性数量的其它序列存在的情况下选择性扩增特定核酸序列。此外，PCR可以将目标序列与差异在于一个单一碱基对的另一个序列区分开。例如，等位基因特异性PCR(AS-PCR)能够检测DNA中的小改变，甚至在野生型、非突变型DNA存在的情况下的单一核苷酸突变(美国专利号6,627,402)。在等位基因特异性PCR测定中，至少一条引物是等位基因特异性的，即设计成优先匹配目标序列(该序列的特异性变体)，但含有与非目标序列(该序列的其它变体)的识别性错配。理想地，只有当等位基因特异性引物杂交至目标序列时才发生引物延伸。在成功的等位基因特异性PCR中，核酸的目标变体得到扩增，而其它非目标变体未进行扩增，至少不会扩增到可检测到的水平。不幸的是，在许多目标的情况下，这种理想是无法实现的。常见的是，在PCR的后面循环中，序列的非目标变体的扩增也变得可检测。该现象被称为“突破扩增”。即使AS-PCR引物与目标序列完美互补(或至少，共享更大程度的互补性)且与非目标序列错配(或者具有更多个错配)，非目标序列的扩增经常不能完全避免。

突破扩增在其中样品含有少量目标序列和大量非目标序列的测定中特别受关注。例如，在靶向肿瘤中的体细胞突变的测定，来自患者样品的细胞中只有一部分是肿瘤细胞。肿瘤细胞的一部分可以含有指示对特定抗肿瘤药物的易感性的突变(参见例如，美国专利号7,294,468和7,960,118中描述的突变)。在此类样品中，少数目标(突变)序列与大量非目标(非突变)序列混合。非突变序列的突破扩增可以产生假阳性结果，假性地指示突变的存在且误导患者的治疗。如果测定的特异性受突破扩增限制，则测定的临床实用性也是如此。

已经提出了防止或降低非特异性扩增的各种方法(例如，影响扩增引物的特异性的化学修饰，参见美国专利号6,011,611；使用阻断剂寡核苷酸，参见美国申请公开号200953720)。然而，这些方法在完全消除突破扩增中并不总是成功的。因此，存在对于防止或尽量减少核酸扩增反应中的突破扩增的替代方法的需求。

发明概述

在一个实施方案中，本发明是用于在核酸扩增反应中使用的抑制寡核苷酸，其具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列。

在另一个实施方案中，本发明是设计用于在核酸扩增反应中使用的抑制寡核苷酸的方法，其包括使用序列比对算法来选择具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列的寡核苷酸。

在又另一个实施方案中，本发明是降低核酸扩增反应中非目标核酸模板的扩增的方法，其包括在具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列的抑制寡核苷酸存在的情况下进行扩增反应。

在又另一个实施方案中，本发明是用于在降低扩增非目标序列的情况下进行扩增反应的试剂盒，其包含具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列的抑制寡核苷酸。

在又另一个实施方案中，本发明是用于在降低扩增非目标序列的情况下进行扩增反应的反应混合物，其包含具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列的抑制寡核苷酸。

在又另一个实施方案中，本发明是具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列的抑制寡核苷酸在核酸扩增反应中以降低非特异性扩增的用途。

附图概述

图1显示通过等位基因特异性PCR扩增人NRAS基因的外显子2(包括密码子12), 其中通过也用作引物之一的抑制寡核苷酸抑制突破。图1A显示未抑制的突破扩增(虚线)，且图1B显示了非目标序列扩增的抑制。

图2显示通过等位基因特异性PCR扩增人NRAS基因的外显子3(包括密码子61)，其中通过不与目标序列互补的抑制寡核苷酸抑制突破。图2A显示在没有抑制寡核苷酸的情况下没有抑制突破扩增，图2B显示当抑制寡核苷酸以低浓度存在时没有抑制，并且图2C显示当抑制寡核苷酸以较高相对浓度存在时的抑制。

图3显示通过等位基因特异性PCR扩增人PI3KCA基因，其中通过不与目标序列互补的抑制寡核苷酸抑制突破。图3A显示在抑制寡核苷酸不存在的情况下的突破扩增，且图3B显示在抑制寡核苷酸存在的情况下突破扩增的抑制。