[发明专利]用于递送生物治疗剂的外切体

说明书

技术领域

本发明涉及用于递送包括抗体和抗体片段的蛋白质或肽的组合物。具体而言，本发明涉及用蛋白质或肽装载的外切体以及产生它们的方法。

背景技术

生物治疗剂通常用于大范围的疾病——包括癌症、遗传病和自身免疫疾病——的治疗和/或预防。生物治疗剂通常是蛋白质或肽，例如抗体或抗体片段并且倾向于以裸露形式施用，即在对递送没有任何帮助。但是，在例如由于快速清除、器官特异性分布的缺少和低效的细胞摄取的一些情况下，可期望在特定的递送媒介中施用生物治疗剂。

外切体是内吞起源的小膜结合囊泡(30-100nm)，其在多泡体与质膜融合之后释放进入细胞外环境。已经对许多免疫细胞，包括B细胞、T细胞和树突细胞(DC)描述了外切体产生。衍生自B淋巴细胞和成熟DC的外切体表达MHC-II、MHC-I、CD86和ICAM-1[1,2]，并且在实验模型和临床试验中已经用于诱导特定的抗肿瘤T细胞毒素应答和抗肿瘤免疫[2,3]。外切体介导的基因递送的潜能已经由递送鼠mRNAs和miRNAs至人肥大细胞显示[4]，并且神经胶质瘤衍生的外切体[5]已经表明将外源DNA质粒产生的mRNA转移至异源细胞。也已经公开了具有外源DNA、siRNA和其他修饰寡核苷酸的外切体[6]。

发明内容

本发明人已成功地用外源蛋白和尤其外源抗体装载了外切体。因此，本发明涉及用包括抗体和其片段的外源蛋白和/或肽装载外切体的方法，用这些外源蛋白和/或肽装载的外切体，以及它们在递送蛋白质和/或肽用于治疗中的用途。

本发明的外切体可具有在它们表面上表达的靶向部分。也描述了融合蛋白，以及编码此类融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白包括外切体跨膜蛋白和靶向部分，其允许在外切体的表面上表达靶向部分。根据本发明，包括靶向部分的外切体可用包括抗体或其片段的外源蛋白和/或肽装载，并且递送蛋白质和/或肽用于治疗。

根据本发明的一个方面，提供了包括外切体的组合物，其中外切体用外源蛋白和/或肽装载。

在另一方面，本发明提供了包括包含蛋白质和/或肽的外切体的组合物，其中外切体衍生自不成熟的树突细胞，其用于体内递蛋白质和/或肽的方法。

在另一实施方式中，本发明提供用蛋白质和/或肽装载外切体的方法，该方法包括提供外切体的组合物，并且通过电穿孔用蛋白质和/或肽装载外切体。

在另一实施方式中，本发明提供用蛋白质和/或肽装载外切体的方法，该方法包括提供外切体的组合物，并且通过使用阳离子脂质体转染试剂的转染用蛋白质和/或肽装载外切体。

附图说明

图1.用包含缀合PE的IgG同型抗体的HEK外切体装载HEK细胞：A显示缀合PE的抗体在HEK细胞中的定位，其中HEK外切体与抗体混合，但不是用电穿孔混合。B显示缀合PE的抗体在HEK细胞中的定位，其中该抗体通过在200mV下的电穿孔装载进入HEK外切体。

图2.用包含FITC-抗生物素蛋白的HEK外切体装载人成纤维细胞：通过在0mV、100mV、200mV和400mV下电穿孔，用FITC-抗生物素蛋白装载转运肽(transportan)-Lamp2外切体。然后用人成纤维细胞温育该外切体，并且测量由成纤维细胞发射的荧光的量。

具体实施方式

本发明涉及外切体，以及它们作为包括抗体和抗体片段的蛋白质和/或肽生物治疗剂的递送媒介的用途。外切体是内吞起源的小膜结合囊泡，其在多泡体与质膜融合之后被释放进入细胞外环境。因此，本申请涉及包括此类外切体的组合物。典型地，外切体的直径在30和100nm之间，但是可包括多达200nm的相似起源的膜颗粒。如本文所使用，外切体指由多泡体分泌的内体起源的纳米颗粒。

外切体由许多不同类型的细胞产生，包括免疫细胞比如B淋巴细胞、T淋巴细胞、树突细胞(DC)和肥大细胞。外切体也由以下产生，例如神经胶质瘤细胞、血小板、网织红细胞、神经元、小肠上皮细胞、肿瘤细胞、HELA细胞、人胚胎肾细胞(HEK细胞)、B2M17细胞、Bend3细胞、原代骨髓衍生的树突细胞、BV-2小胶质细胞和脑神经瘤(NEURO2A)细胞。根据本申请使用的外切体可衍生自任何适合的细胞，包括以上识别的细胞。外切体也已经从生理液体分离，比如血浆、尿、羊膜液和恶性积液。