[发明专利]抗体库筛选的一般策略

说明书

噬菌体展示技术最初是在早于25年前被George Smith引入的(Smith1985)，并且已经变成分子生物技术中不可或缺的工具用来自巨大库的预先确定的结合特性鉴定肽特别是鉴定抗体分子。从那以后，许多改进被报道，筛选概念现在可以用来鉴定针对几乎任何靶蛋白的结合分子(Bradbury等，2011)。而且，近年来细菌特别是酵母菌表面展示已经变成越来越普及的替代方式用于噬菌体展示库筛选应用(Pepper等，2008，van Blois等，2011)。

库筛选通常涉及将一群结合分子暴露于复制实体的表面并使它们与目标物的相互作用配偶体(partner)接触，其在抗体展示的情况下为抗原分子。设计实验装置使得那些展示靶标-特异性抗体的噬菌体颗粒或微生物细胞可从群体中分离出来，例如通过生物淘选或细胞分选分离。理想地，需要单轮筛选以获得期望的蛋白变体。然而，特定结合剂的富集受非特异性结合限制，其需要递归多轮的筛选和扩增以从库中获得最佳结合剂(Vodnik等，2011)。尤其第一轮筛选很关键，因为对于巨大的库可以预见特定的结合剂仅仅构成初始群的极小部分使得非特异性结合剂很大程度上超出特异性相互作用的结合剂。因此，必须仔细地控制条件并使其最优化用于每一单个筛选实验，其中筛选实验是足够严格的以除去非特异性结合剂但足够温和以保留完整的特异性相互作用的库成员的靶向结合(Liu等2009)。

由于获得高亲和性结合剂的概率随库的大小而增加(Steiner，Forrer2008)，已经建立了越来越大的可超过10¹⁰不同变体的库(Rothe等，2008，Brockmann等，2011)。然而，已知在每个筛选轮次中发生的重复扩增将减少在库筛选实验中可鉴定的候选物的多样性并限制其数量。(Derda et al.2011)。因此，非常期望将筛选轮的数目减少至最小，最好是减少至单轮。从概念上，这可以通过建立一种方法来实现，其中靶标和库成员之间瞬时和相对弱的相互作用转化为标记分子的共价连接，其可作为纯化处理使用，并允许应用相当严格的条件除去非特异性结合的库成员。

催化报道分子沉积(CARD)已经广泛用于蛋白生物素化的免疫组织化学(Bobrow等，1989，1991，1992)。它依赖于辣根过氧化物酶(HRP)介导的生物素酪酰胺基团的形成，其中生物素酪酰胺基团容易与附近的蛋白质起反应导致生物素和蛋白质上的酪氨酸残基之间形成共价键(附图1)。为了建立靶分子结合的噬菌体或细胞表面展示库成员的选择性生物素化，我们利用了HRP介导的生物素化需要过氧化氢存在的事实。本文中描述的³CARD系统结合了三种不同酶即过氧化物酶、氧化酶和过氧化氢酶的活性。首先，将HRP偶联到起始群的所有成员上，以在噬菌体展示库的实验环境中使用为例(附图1a)。通过HRP的噬菌体生物素化需要生物素酪酰胺(附图5)和过氧化氢的存在。在³CARD装置(setup)中H₂O₂由与目标抗原缀合的第二酶产生(附图1b，c)。作为半乳糖或葡萄糖氧化酶的糖氧化酶通过电子转移催化糖氧化为氧，这导致过氧化氢的形成。过氧化氢仅仅在那些抗原-氧化酶复合物结合的噬菌体颗粒上以较高的浓度产生，因为反应混合物含有非常有效地分解过氧化氢的作为第三酶的过氧化氢酶。结果H₂O₂迁移至HRP且随后仅极接近于HRP处有氧化酶的结合抗原的噬菌体发生噬菌体生物素化。然后特异性标记的噬菌体可通过固定化的链霉抗生物素蛋白的生物淘选收集并在噬菌体感染细菌之前经受非常严格的洗涤条件。

然而在本领域中没有提及CARD用于提高噬菌体、细菌或酵母菌展示系统的效力。

在本领域非常需要提高这种效力。如上所解释的，特定结合剂的分离还很大程度上靠经验，要求实验设置基本上适应包含给定的展示系统和特定配体的每一个特定的装置。

因此，本发明的目的是提供一种尤其(i.a.)可以减少分离高特异性的结合剂所需要的选择/扩增步骤的有效的展示系统。

本发明公开了令人惊奇地易于建立和高效改进本领域已知的展示系统。

在第一实施方案中本发明涉及一种分离特异性标记的复制实体的新方法，所述方法包含

a)提供在反应混合物中的一组复制实体，其在其表面上展示受体分子的变体且具有与所述表面连接的第一酶或第二酶中的任何一种，