[发明专利]经修饰的百日咳博德特氏菌菌株

权利要求书

1.一种经遗传修饰的百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)菌株，

其中：

百日咳毒素S1基因经修饰而包括Arg9→Lys9和Glu129→Gly129突变；且

ptx操纵子的一个拷贝整合到经修饰的百日咳博德特氏菌菌株的染色体的非功能区，由此经修饰的天然ptx操纵子和整合的ptx操纵子分开定位于所述染色体中，其中整合的ptx操纵子包含一组S1-S5基因且不包含任何ptl基因，且其中所述整合的ptx操纵子的S1基因也经修饰而包括Arg9→Lys9和Glu129→Gly129突变；

其中使用包含I-SceI核酸酶基因的载体pSS4245将所述突变和所述整合的ptx操纵子引入所述百日咳博德特氏菌菌株，由此经修饰的菌株不包括任何整合的抗生素抗性基因和任何其它瘢痕，且能够表达去毒的百日咳毒素(rPT)，且

其中经修饰的百日咳博德特氏菌菌株能够表达相对于仅具有一个ptx操纵子的菌株水平增强的去毒的百日咳毒素，并且还能够表达丝状血凝素(FHA)和百日咳杆菌粘附素。

2.根据权利要求1所述的经遗传修饰的百日咳博德特氏菌菌株，其中载体pSS4245和包括斯坦纳-斯科尔特培养基(MSS)琼脂和烟酸的培养系统用于引入所述S1突变而不整合抗生素抗性基因和任何其它瘢痕。

3.根据权利要求1所述的经遗传修饰的百日咳博德特氏菌菌株，其为Tohama菌株。

4.根据权利要求1所述的经遗传修饰的百日咳博德特氏菌菌株，其已通过以下而进一步修饰：

将在天然PRN启动子控制之下的编码百日咳杆菌粘附素的prn基因的一个拷贝整合到所述经修饰的菌株的染色体的非功能区中，所述经修饰的菌株由此具有分开定位在所述染色体中的天然prn基因和第二prn基因，所述经修饰的菌株由此能够表达相对于仅具有一个prn基因的菌株水平增强的百日咳杆菌粘附素；

其中使用载体pSS4245引入所述prn基因的拷贝，使得所述经修饰的菌株不包括任何整合的抗生素抗性基因和任何其它瘢痕。

5.根据权利要求4所述的经遗传修饰的百日咳博德特氏菌菌株，其中所述ptx操纵子和/或prn基因的拷贝整合于非功能假基因之内或之间。

6.一种生产经修饰的百日咳博德特氏菌菌株的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将Arg9→Lys9和Glu129→Gly129突变引入百日咳博德特氏菌菌株的S1基因中；以及

(b)将ptx操纵子的一个拷贝整合到百日咳博德特氏菌菌株的染色体的非功能区，由此经修饰的天然ptx操纵子和整合的ptx操纵子分开定位于所述染色体中，其中整合的ptx操纵子包含一组S1-S5基因且不包含任何ptl基因，且其中所述S1基因也经修饰而包括Arg9→Lys9和Glu129→Gly129突变；

其中使用包含I-SceI核酸酶基因的载体pSS4245引入所述突变和整合的ptx操纵子，由此导致产生不包括任何抗生素抗性基因和任何其它瘢痕的经修饰的菌株，且

其中经修饰的百日咳博德特氏菌菌株能够表达相对于仅具有一个ptx操纵子的菌株水平增强的去毒的百日咳毒素(rPT)，并且还能够表达丝状血凝素(FHA)和百日咳杆菌粘附素。

7.根据权利要求6所述的方法，其中使用载体pSS4245和包括斯坦纳-斯科尔特培养基(MSS)琼脂和烟酸的培养系统引入所述S1突变而无整合的抗生素抗性基因和任何其它瘢痕。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述百日咳博德特氏菌菌株是Tohama菌株。

9.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括以下步骤：

将在天然PRN启动子控制之下的编码百日咳杆菌粘附素的prn基因的一个拷贝整合至所述经修饰的菌株染色体的非功能区中，由此生产经修饰的菌株，所述经修饰的菌株具有分开定位于所述染色体中的天然prn基因和第二prn基因，所述经修饰的菌株由此能够表达相对于仅具有一个prn基因的菌株水平增强的百日咳杆菌粘附素；

其中使用载体pSS4245引入所述prn基因的拷贝而未整合任何抗生素抗性基因和任何其它瘢痕。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述ptx操纵子和/或所述prn基因整合于非功能假基因之内或之间。