[发明专利]经修饰的百日咳博德特氏菌菌株

说明书

技术领域

本发明描述了衍生于标识为Tohama的母株并使用载体pSS4245整合突变和其它(附加，additional)基因拷贝的重组百日咳博德特氏菌(百日咳杆菌，Bordetella pertussis)菌株的构建。

背景技术

百日咳(Pertussis)或百日咳(whooping cough)是由上呼吸道的百日咳博德特氏菌感染所致的严重婴儿疾病[1]。疫苗已经面世几十年，其由百日咳博德特氏菌的灭活全细胞构成。它们作为三价白喉-破伤风-百日咳组合或者作为还提供抗乙型肝炎和b型流感嗜血杆菌侵袭性疾病的免疫力的新组合进行给药[2]。在少数几个国家中由于其令人质疑的安全谱使用全细胞疫苗已经减少、不鼓励或甚至受禁，这种令人质疑的安全谱是由于高水平内毒素和与灭活全细胞相关的其它细菌毒素所致[3,4]。

无细胞疫苗，以它们不包含全细胞而只有部分或广泛纯化的细菌抗原而得名，在1981年引入日本[5]。在无细胞疫苗中的所述组分抗原的较高纯度解读为到改善的临床安全谱。这些疫苗在验证其安全性和有效性的广泛现场试验之后于90年代中期引入工业化国家[6]。然而，由WHO更广泛引入到免疫扩展计划项目(Expanded Program of Immunization)却受阻于无细胞疫苗的显著较高的成本。

百日咳博德特氏菌的主要毒力因子是百日咳毒素(PT)[7,8]而百日咳类毒素(PTd)是无细胞疫苗中的主要抗原[8]。不像白喉和破伤风毒素，可以通过甲醛的简单处理而失活，PT已经证明更难以通过化学方法灭活[9]。目前，不同的失活方法都适用于商业化生产。在广泛通用的PT变性中所有都是通过化学处理所致。两候选疫苗都是使用遗传灭活毒素(rPT)进行探究的[10～12]而这些候选疫苗之一列入了现场药效试验中[11-12]。

然而，含rPT的疫苗尚不可获得。

发明内容

根据本发明的第一实施方式，提供了一种经遗传修饰的百日咳博德特氏菌Tohama菌株，其中所述Tohama菌株的具有ATCC登记号BAA-589的所述百日咳毒素S1基因，具有Arg9→Lys9和Glu129→Gly129突变并且由于所述突变而并未包括整合的抗生素抗性基因，其中所述经修饰的菌株能够表达去毒的百日咳毒素(rPT)。

载体pSS4245可以用于引入所述S1突变而并未整合抗生素抗性基因。

所述菌株可以通过使用载体pSS4245将所述ptx操纵子的拷贝整合到所述经修饰的Tohama菌株染色体的非功能区而进一步进行修饰，其中所述整合的ptx操纵子包含一组S2-S5基因和经修饰而包括所述突变Arg9→Lys9和Glu129→Gly129的S1基因，所述经修饰的菌株由此具有两个分开定位在所述Tohama染色体中的ptx操纵子而并未整合抗生素抗性基因，并能够表达相对于仅具有一个ptx操纵子的菌株水平增强的去毒的百日咳毒素。

所述ptx操纵子的拷贝可以整合于非功能假基因(伪基因，pseudogene)之内或之间。

所述ptx操纵子的拷贝可以整合于假定的(putative)铵转运子(铵转运蛋白，ammonium transporter)假基因amtB和假定的自主转运子(自主转运蛋白、自转运蛋白，autotransporter)假基因之间。

所述整合的所述ptx操纵子的拷贝可以受控于ptx-ptl操纵子启动子之下。

其它所述ptl操纵子的拷贝可以不引入到所述菌株中。

所述菌株可以包括多于一个所述经修饰的ptx操纵子的插入拷贝。

所述菌株可以进一步通过使用载体pSS4245将编码百日咳杆菌粘附素(Pertactin)的prn基因的拷贝整合到所述经修饰的Tohama菌株染色体的非功能区中进行修饰，所述经修饰的Tohama菌株由此具有两个分开定位在所述Tohama染色体中的prn基因而未整合抗生素抗性基因，而所述经修饰的Tohama菌株能够表达相对于仅具有一个prn基因的菌株水平增强的百日咳杆菌粘附素。

所述插入的prn基因可以位于非功能假基因之内或之间。

所述prn基因的拷贝可以整合于假定的谷胱甘肽S-转移酶假基因(pseudo-putative glutathione S-transferase gene)和假定的天冬氨酸消旋酶假基因(pseudo putative aspartate racemase gene)之间。

所述prn基因的拷贝可以受控于prn启动子之下。