[发明专利]选择性量化A-β聚集体的方法

说明书

本发明涉及选择性量化A-β聚集体的方法，包括将A-β捕获分子固定在基材上，将待研究的样品施加于基材上，加入用于检测的标记的探针，其通过特异性结合A-β聚集体标记这些探针，并检测经标记的聚集体。

A-β聚集体出现于阿尔茨海默病(AD，阿耳茨海默氏痴呆，拉丁语＝Morbus Alzheimer)。其包括帕金森氏病例如属于一种由不同种类组成的临床病症，其共同标准在许多情况(但不排除其它情况)下是各个特定蛋白质以β折叠结构的有序构象的细胞外全身性或局部沉积。由年龄决定的痴呆是当今社会中一个越来越大的问题，这是因为由于提高的预期寿命，越来越多的人遭受其苦并因此对社会保险系统和其可资助性产生影响。

内源蛋白质病理学聚集体，例如寡聚物或纤丝，出现于许多神经变性疾病中。在阿尔茨海默痴呆的情况下，例如在大脑中发现β淀粉样肽沉积物(A-β肽沉积物)和在帕金森氏病情况下，共核蛋白(Synuclein)沉积物。然而，β淀粉样肽沉积物(或肽-纤丝)仅是过程的最后阶段，其以从来自APP(淀粉样前体蛋白)的单体β淀粉样肽的分裂开始，然后形成神经毒性的β淀粉样肽寡聚物并最后以斑点中的β淀粉样肽纤丝的沉积物结束。AD的主要病理学特征是由A-β肽组成的老年斑或淀粉样斑的形成。此外，产生来自Tau蛋白的神经纤丝沉积物。A-β肽的前体蛋白质，APP，定位于神经元的细胞膜中。通过蛋白质水解降解和之后的修饰，由此产生不同长度和类型的A-β片段，例如A-β1-40、A-β1-42、或pGluA-β3-42。单体A-β肽也在健康机体的整个一生期间都产生。

按照自1990年代的淀粉样蛋白级联假说，以斑点形式的A-β沉积物是疾病症状的触发者。然而近年来，不同的研究表明，特别是小的、自由扩散的A-β寡聚物在所有A-β类别中具有最大的毒性，并且对AD的发生和进展负责。因此，A-β肽的聚集体与AD发病机理直接相关。

然而目前，可靠的诊断在引人关注的临床症状出现以后才是可能的，在这种情况下，以最大90％的可靠性为出发点。目前存在的至今唯一可靠的诊断可能，直到患者死亡后通过大脑中各种不同改变的组织学检测。

因此，需要鉴定和量化估计A-β聚集体，尤其是小的、自由扩散的A-β寡聚物或聚集体的方法。

迄今为止仅仅描述了几种表征和量化组织和体液中致病性聚集体或寡聚物的方法。

与A-β结合并抑制其聚集的化合物例如由Chafekar等(ChemBioChem 2007，8，1857-1864)获知。这些物质由A-β肽(KLVFF序列)中的部分组成并用于治疗目的，没有用这些物质进行组织和体液中的致病性聚集体或寡聚物的表征和量化。

目前，对于AD，还没有公认的标准和/或鉴定，所谓的生物标志物。至今这种生物标志物的出发点是使用PET放射性示踪剂用于成像方法，这基于放射活性标记的物质结合淀粉质斑块的假设并因此在检测之后可以是斑块沉积的测量。尽管在PET信号和疾病之间有显而易见的联系，但至今仍不能由此使可靠的诊断成为可能，因为许多没有老年痴呆的人也表现出高示踪剂保留。高成本和在仪器上必要的技术开支对这些方法也是不利的，其中仪器并不是随处可获得的。

作为其它的出发点，目前正在研究患者的血液或脊髓液(CSF)中多种物质的量和分析它们作为生物标志物有用性。这些物质之一为A-β肽。迄今为止，患者脊髓液中单体A-β含量的测定，可能地与Tau浓度的测定相结合似乎最可靠。然而，该值有如此高的变化以致不能利用这种生物标志物对个体进行可靠的诊断。这种方法的应用由DE69533623 T2获知。尽管有这些不同的方法，但迄今为止任何可靠的生物标志物得到公认还是不可能的。

其它困难是对于A-β聚集体的具体量化与A-β单体和/或A-β总含量相反，迄今为止只有几种检测系统可获得。作为可能的检测系统，目前采用ELISAs，其中A-β寡聚物利用抗体检测。其中所用的抗体识别仅非常特异性的类型的A-β寡聚物或不是由A-β肽构成的非特异性的其它寡聚物，但在非常不同的蛋白质中，其对评价有不利的影响。

利用构象异构体-特异性抗体应用ELISA支持的方法例如由WO2005/018424 A2获知。