[发明专利]核酸的定量、高度多重检测

权利要求书

1.一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括：用具有核酸酶活性的聚合酶对所述样品进行扩增反应，所述扩增反应在包含第一探针的试剂的存在下进行，所述第一探针包含与所述靶核酸序列互补的第一部分和不与该第一靶核酸序列互补的第二部分，所述第二部分包含第一位置上的与所述第二部分偶联的第一猝灭剂部分，从而当所述靶核酸序列被扩增时，所述第二部分从所述第一部分被切下成为第一探针片段；

使所述第一探针片段与固定在基材上的捕获探针杂交，其中所述捕获探针包含被所述第一猝灭剂部分至少部分猝灭的荧光团，所述荧光团偶联至所述捕获探针上的第二位置，从而在所述探针片段与所述捕获探针杂交之后，所述荧光团至少部分被所述猝灭剂猝灭；以及

基于所述捕获探针上所述荧光团的猝灭来检测所述靶序列的存在。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述扩增试剂包括多种不同的探针，所述多种不同的探针具有与不同靶核酸序列互补的多种不同的第一部分和不与多种靶核酸序列互补的不同的第二部分，所述第二部分各自包含偶联至所述第一位置上的猝灭剂部分，所述多种第二部分在所述多种靶核酸序列扩增后被切割成探针片段；以及

其中所述基材包含在所述基材上排列的多种不同的捕获探针区域，各捕获探针区域包含与所述多种不同的探针的不同第二部分互补的捕获探针，并且各捕获探针包含被所述猝灭剂部分猝灭的荧光团。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一位置包含所述探针片段的5＇端，而所述第二位置包含所述捕获探针的3＇端。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，各捕获探针区域包含与所述探针片段杂交的非速率限制数量的捕获核酸。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，与所述捕获探针杂交的所述第一探针片段的长度小于约30个核苷酸。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，与所述捕获探针杂交的所述第一探针片段的长度小于约20个核苷酸。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，与所述捕获探针杂交的所述第一探针片段的长度小于约15个核苷酸或更短。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述检测前将所述靶核酸扩增至少5轮扩增循环。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述检测前将所述靶核酸扩增多轮扩增循环，其中，所述检测后在该探针的额外拷贝的存在下另扩增所述靶核酸部分，所得释放的第一探针片段随后与所述阵列杂交并被检测，其中检测到的信号强度与所述样品中存在的靶核酸的量相关联。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杂交温度低于所述扩增反应的温度。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括检测所述阵列的一个或多个区域的局部背景，和通过针对所述背景校正来使信号强度测量值标准化。

12.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述样品包含多种靶核酸。

13.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述多种不同的捕获探针在所述阵列上空间分离。

14.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述扩增反应中存在约5-约100种不同的捕获探针，和约5-约100种对应的探针，其中基于所述信号在所述阵列上定位可以检测多至5-100种不同的信号。

15.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述捕获探针以约350fmol/cm²-约5000fmol/cm²或更大的密度排列在所述基材上。

16.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述捕获探针以超过2000fmol/cm²的密度排列在所述基材上。

17.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述多种不同的捕获探针包含相同的标记物部分，并且所述多种不同的探针片段包含相同的猝灭剂部分。

18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增步骤和将所述第一探针片段与所述基材杂交的步骤在相同温度下进行。