[发明专利]核酸的定量、高度多重检测

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求2012年2月17日提交的美国专利申请号13/399,872的优先权，其要求2011年2月18日提交的美国临时专利申请号61/463,580和2011年11月17日提交的美国临时专利申请号61/561,198的优先权，各所述专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。

联邦资助的研究与开发下作出发明的权利声明

本发明在美国国土安全部第HSHQDC-10-C-00053号基金资助下进行。政府可享有本发明的某些权利。

发明领域

本发明属于实时DNA扩增、检测和定量领域，以及相关耗材(consumable)、装置和系统(包括阵列)领域。

发明背景

实时PCR常规用于对生物样品中感兴趣核酸的检测。实时PCR的综述参见，例如M Tevfik Dorak(编)(2006)Real-time PCR(Advanced Methods)(《实时PCR(高级方法)》)，TF公司(Taylor & Francis)，第一版ISBN-10：041537734X ISBN-13：978-0415377348，和Logan等(编)(2009)Real-Time PCR：Current Technology and Applications(《实时PCR：新编技术和应用》)，Caister学术出版社，第一版ISBN10：1904455395，ISBN-13：978-1904455394。其他细节还可参见例如Gelfand等，“Homogeneous Assay System Using The Nuclease Activity ofA Nucleic Acid Polymerase(使用核酸聚合酶的核酸酶活性的均匀分析系统)”USP5,210,015；Leone等，(1995)＂Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enable homogenous real-time detection of RNA(分子信标探针与NASBA扩增的结合能均匀实时检测RNA)＂Nucleic Acids Res.26：2150-2155；以及Tyagi和Kramer(1996)“Molecular beacons：probes that fluoresce upon hybridization(分子信标：基于杂交的荧光探针)”NatureBiotechnology14：303-308。传统上，用于在单一反应容器(如多孔板的孔)中检测多于一种靶核酸/样品的单孔多重技术(multiplexing)利用对各扩增子具有特异性的自淬灭PCR探针(诸如TAQMAN^TM或分子信标探针的)来实现。在与溶液中的扩增子结合后，或在PCR过程中的探针降解后，所述探针不淬灭(unquench)，生成可检测信号。所述探针用不同波长的荧光团标记，从而允许单个“单罐式”反应中至多约5个靶标的多重技术能力。由于实际光谱范围和标记物发射的限制，很难实现超过约5个探针/反应。这严重限制了单一反应的多重化，进而严重限制了能被筛选的靶标数量/样品，并提高了检测多种感兴趣靶标的成本和设备复杂性。

核酸阵列代表另一种使扩增产物的检测多重化的方法。最常见地，对样品进行扩增反应，然后在核酸阵列上分别检测扩增子。例如Sorge“Methods for Detection of a Target Nucleic Acid Using A Probe Comprising Secondary Structure(使用包含二级结构的探针检测靶核酸的方法)”US6,350,580提出了通过从扩增混合物纯化探针并随后检测该探针来捕获扩增后释放的探针。这种生成和检测扩增子的多步法使对于扩增混合物的实时分析变得不切实际。