[发明专利]用于鉴定培养物中微生物的光谱手段和方法

说明书

相关申请引用

本申请要求于2011年12月19日提交的US临时专利申请号61/577,131的优先权，其通过引用被整体并入本文。

技术领域

本发明涉及用于鉴定培养物中微生物的光谱(spectroscopic)手段(means)和方法。特别地，本发明涉及用于鉴定培养物中微生物的手段和方法，其依赖于整个细胞的光谱测量，而非细胞特定的化学组成，以及涉及整合其他基于光之测量方法(例如干涉分析法)的手段和方法。

背景技术

微生物的鉴定，特别是抗生素抗性细菌的检测，在医药领域中是极其重要的。众所周知，卫生保健机构投入了大量的努力来防止患者受到由环境细菌且特别是由于那些抗生素抗性细菌所引起之二次疾病的感染。

通常用来区分抗生素抗性细菌和抗生素敏感性细菌的方法是直接对样品使用PCR或在培养样品后使用PCR。这样的方法公开在例如US专利号4,683,202中。另一种方法是通过检测蛋白质组，即通过基因组表达的不同蛋白质。

通过常见细菌性病原体的检测用于通用细菌检测的基于DNA的方法也是本领域已知的，例如，如美国专利申请公开号2005/0042606中公开的。在PCT公开号WO90/04041中已经公开了通过将从样品获得的细菌培养物暴露于具有已知宿主范围的转导颗粒检测有活力的细菌。

这些方法的问题在于它们一般花费显著量的时间(通常至少一小时)来产生结果，且仅可由合格的专业技术人员进行。解决这些问题的一个可能途径可为光谱技术的使用，其本质上比这些方法快。一些用于鉴定细菌而不对抗生素抗性菌株特异的光谱方法在本领域中是已经的。

例如，PCT公开号WO98/41842公开了通过拉曼光谱法(Raman spectroscopy)来检测细菌抗体复合物的系统。将用于测试细菌存在的样品放置于培养基中，所述培养基含有连接到一表面的抗体，所述抗体用于结合至特定细菌以形成抗原-抗体复合物。类似地，共振拉曼反散射作为鉴定细菌的方法在U.S.专利公开号4,847,198中公开。在这些方法中，将与特定细菌相关之标记物在拉曼光谱中的存在作为细菌存在的指示。

U.S.专利号6,379,920公开了用于检测和鉴定生物样品中特定细菌的光谱方法，对于其所要求保护的来说，培养是不必需的。所述方法包括从未感染的患者获得生物样品的光谱作为参考，将所述参考从可能感染的样品光谱减去，并将产生的差异光谱的指纹区与已知细菌的参考光谱进行比较。

Naumann等(Encyclopedia of Analytical Chemistry，R.A.Meyers(编)102-131页，John Wiley&Sons Ltd，Chichester，2000)已经报道了在干燥的样品中用于鉴定和分类细菌的FTIR光谱的用途。通过使用FTIR和近红外FT-拉曼光谱，已经鉴定了活微生物。其他方法包括使用荧光光谱法或以上光谱技术的组合。

现有技术文献均未公开可以快速(少于1小时)且不需要专业技术人员检测并且区分抗生素抗性细菌和抗生素敏感性细菌的手段和方法。而且，现有技术文献均未公开可以排除样品中所含的水对实验信号的干扰从而提供更灵敏和更准确的一般细菌和特定抗生素抗性细菌之检测的手段和方法。

因此，对于迅速、灵敏并准确地从原代培养板样品检测和鉴定微生物，而不使用另外的试剂或复杂的样品制备之手段和方法，特别是可以将抗生素敏感性细菌和抗生素抗性细菌区分的手段和方法，存在长期的需要。

发明内容

本文公开的发明设计为满足该长期需要。本发明公开了用于光谱鉴定培养物中微生物的方法和系统。特别地，本文公开的方法包括将因水产生的光谱中的伪差(artifact)移除的步骤，使用主成分分析(Principal Components Analysis)来提取目的光谱特征，并使用学习算法(learning algorithm)(例如RANDOM FOREST分类器方法)来将光谱特征图(signature)分类。所述方法还整合了通过使用多模态(multimodal)技术区分抗生素抗性细菌(例如甲氧西林抗性金色链球菌(Streptococcus Streptococcus aureus)(MRSA))与抗生素敏感性细菌(例如甲氧西林敏感性金色链球菌(MSSA))的步骤，所述多模态技术将确定样品中细菌的至少一种化学特征的光谱法以及(suspuses)确定细菌细胞壁厚度的干涉分析法组合。