[发明专利]通过包含激光扫描显微镜的测量装置测量三维样品的方法及该测量装置

说明书

技术领域

本发明涉及一种以具有三维测量空间且包含激光扫描显微镜的测量系统进行样品的三维测量的方法。本发明还涉及这种测量系统。

背景技术

根据技术发展水平，现存许多三维成像装置(CT，MRI，超声波，多种激光扫描方法，例如共焦显微镜、双光子显微镜、三维双光子显微镜、旋转盘共焦显微镜、原子力显微镜)。这些装置通常连接到常规计算机构造，即，由测量产生的三维(3D)信息作为二维(2D)投影显示在监视器上。医学上，信息的生物学应用快速感知和快速决策较重要，因为生物样品通常具有短的寿命，或者测量的现象可仅在有限时间周期内观察到。在这种样品的情况下，客观事实是：经常通过执行外科手术交互或实验而改变检查样品。在一些实例中，使用立体显示以增强对所获数据的观察，然而，观察与对样品进行的测量和物理交互时间上是分开的。

生物样品的三维测量可由三维(3D)激光扫描显微镜执行，其通过逐点扫描样品来实施测量。3D激光扫描技术在分析生物样品，尤其在成像三维生物结构和追踪这种结构不同时间量程上的变换方面非常重要。

通常使用的3D激光扫描显微镜为共焦显微镜或双光子显微镜。在共焦显微镜技术中，小孔布置在检测器之前以滤除由显微镜物镜的焦平面之外的任何其它平面反射的光。因此，可成像位于样品(例如，生物样本)中不同深度的平面。

双光子激光扫描显微镜使用较低能量的激光光，其中一量子事件中需要两个光子激发荧光团(flourophore)，导致荧光光子的发射，其然后由检测器检测。接近同时吸收两个光子的可能性极低，需要高通量的激发光子，因此双光子激发实际上仅在激光束的焦斑(即，通常具有约300nm x300nm x1000nm的尺寸的小椭圆体体积)中发生。通常，飞秒脉冲激光用于提供双光子激发所需的光子通量，同时保持平均激光束强度足够低。

当应用上述技术之一时，3D扫描可通过例如由步进马达移动样品台来执行，然而，这在使用浸没样本室或在用微电极在生物样本上执行电记录时难以实施。因此，在分析生物样本的情况下，通常优选移动激光束的焦斑而不是移动样本。这可通过偏转激光束以扫描焦平面(XY平面)的不同点以及通过由例如压电定位器沿物镜的光轴(Z轴)移动物镜以改变焦平面的深度来实现。存在几个已知技术用于在激光束进入物镜之前例如通过偏转安装在检流计扫描仪上的反射镜或通过声光偏转器来偏转激光束。

另一可能性在于使用所谓的全息显微术，其中期望的二维或三维扫描效果通过使用空间光调制器(SLM)实现(Volodymyr Nikolenko,Brendon O.Watson,Roberto Araya,Alan Woodruff,Darcy S.Peterka and Rafael Yuste,2008,Frontiers in Neuronal Circuits)。可与先前系统结合使用的用于执行3D扫描的新技术是所谓的时空复用显微镜，即，空间脉冲分离(Adrian Cheng,J TiagoPeyman Golshani,Katsushi Arisaka,Carlos Portera-Cailliau,2011,Nature Methods)。在该方法中，单个激光脉冲由分束器分为多于一个的部分，每一个子脉冲以不同的时间延迟聚焦在不同的平面，因为每一个子脉冲穿过将子脉冲成像至不同焦平面的不同成像系统。为了空间扫描，时间顺序上冲击的子脉冲由快速光子计数检测器分开。

检流计扫描仪和声光偏转器是极快的装置，因此移动焦斑至期望的XY平面位置以及在该位置通过检测器获得测量数据可在少于1μs内进行。然而，由于显微镜物镜的迟钝，Z定位耗费实质上更多的时间，致使3D扫描为漫长的操作。

为了实现本领域通常接受的信号噪声比，且假设平均物镜和平均样品大小，测量可花费许多分钟(例如，以优选具有大于光学分辨率的分辨率的双光子显微镜扫描512 x 512 x 200个像素的体积，测量可花费5-20分钟)。然而，在生物样品中发生的快速生理反应为ms量级(例如，动作电位，突触信号传输)。扫描显微镜的测量时间可通过仅沿相关区域、曲线、点测量而省略样品的其它部分而减少。这种技术例如公开在WO2010/007452中。然而，该技术与相似技术的应用首先需要空间选择3D样品的一部分。