[发明专利]通过三维培养重新编程细胞

说明书

发明背景

干细胞的特征在于其具有增殖能力，同时保持形成特定细胞类型的潜能和分化能力。这种特征也被称为干性，其赋予了干细胞在科研和治疗应用方面广阔的前景。细胞干性受到了广泛关注，特别是如何重新编程体细胞以获得干性。Yamanaka等此前的工作表明，通过强制过表达关键转录因子，能够由体细胞产生万能干细胞(pluripotent stem cells)，从而建立了一种操纵干性的新方法(Takahashi和Yamanaka,2006)。从那时起，已大力致力于设计更加安全和更加有效的用于诱导性万能干细胞(iPS)的方法，如利用蛋白(Kim等，2009；Zhou等，2009)、RNA(Warren等)、microRNA(Anokye-Danso等)或特定的化学品(Shi等，2008；Zhu等)。尽管已证实这些方法在操纵所述细胞的干性方面是有效的，但是其效率和风险控制仍有待改进。因此，仍需寻找重新编程细胞的替代方法。

发明概述

本申请的一个方面涉及将细胞重新编程的方法，所述方法包括在允许形成三维(3D)细胞聚集体的条件下培养所述细胞，其中所述细胞被诱导进行重新编程。

在某些实施方式中，在低粘附基质上培养所述细胞，以形成三维细胞聚集体。在某些实施方式中，所述低粘附基质包括亲水性的和电中性的水凝胶层。在某些实施方式中，所述低粘附基质包括疏水性表面。

在某些实施方式中，在悬挂在支持材料上的培养基液滴中悬浮培养所述细胞，以使得形成三维细胞聚集体。

在某些实施方式中，所述三维细胞聚集体是多细胞和多层细胞聚集体。在某些实施方式中，所述三维细胞聚集体具有球样形状。

在某些实施方式中，所述细胞被重新编程以上调一种或多种干细胞标记物。在某些实施方式中，所述细胞被重新编程以上调一种或多种转分化标记物。

在某些实施方式中，所述方法还包括向所述培养物中引入诱导剂。在某些实施方式中，所述诱导剂是能够诱导细胞重新编程的蛋白。在某些实施方式中，所述诱导剂是编码蛋白的核酸，所述蛋白能够诱导细胞重新编程。在某些实施方式中，所述诱导剂是能够诱导细胞重新编程的化合物。

本申请的另一个方面涉及使用本申请中提供的任意方法获得的重新编程细胞。

本申请的另一个方面涉及使用本申请中提供的任意方法获得的重新编程三维细胞聚集体。

本申请的另一个方面涉及用于将细胞重新编程的试剂盒，所述试剂盒含有低粘附基质和，任选地，培养基。

附图简述

图1：RT4细胞的3D球体的形成导致干细胞标记物的表达：

A.在单层(左图)和球体培养物(右图)中RT4细胞的相差图像。比例尺＝200μm。

B.在单层和球体培养物中的RT4细胞干细胞标记基因的定量PCR(Q-PCR)分析结果。

C.在单层和7天球体培养物中的RT4细胞NANOG和SOX2表达情况的Western印迹结果。使用畸胎瘤细胞系PA-1作为阳性对照。

图2：RT4细胞的3D球体的形成产生具有癌干细胞特征的细胞。

A.在单层(左图)和7天球体培养物(右图)中迁移细胞的定量分析结果。

B在单层和7天球体培养物中的RT4细胞上皮间质转化(EMT)相关基因的Q-PCR分析结果。