[发明专利]获得并检测待鉴定对象之标志物的方法、相关标志物、认证方法以及验证方法

权利要求书

1.用于获得待鉴定对象之标志物的方法，其至少包括选择用于DNA提取之生物的第一步骤以及测定并校正溶液流动性程度的第八步骤；其特征在于还包括：

·第二步骤，其将所获得的样品包含在含有9至10.2mM Tris-HCl；0.95至0.11的EDTA；20％SDS(重量/体积)以及9.8至10.3mg/mL蛋白酶K的溶液中，并以10∶9(体积/体积)比值的苯酚/氯仿进行纯化；

·第三步骤，扩增存在于DNA样品中的短串联多态性片段(STR)或单核苷酸多态性(SNP)；

·第四步骤，确定所选多态性片段的等位基因变体；

·第五步骤，修饰多态性STR/SNP片段的三维结构并吸附至至少一种金属的纳米颗粒；

·第六步骤，多态性片段的浓缩和微囊化；和

·第七步骤，通过拉曼光谱检测DNA微球或微囊化DNA的增溶作用。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述第五步骤中，所述金属选自金、银、铂或者铜。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述第五步骤中，通过选自以下的方法来修饰DNA的三维结构：

I.单独添加或作为吸附了DNA以与所述DNA分子产生例如二聚体、三聚体或四聚体之聚集体的金属纳米颗粒的胶体添加；将选自聚合物、硅烷或烷及其衍生物的至少一种连接基团添加至所述金属纳米颗粒，并且其中所述聚合物选自苯乙炔、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺或类似物，

II.添加DNA复合物-树状聚体PAMAM类型或类似物以形成具有单拉曼光谱的特征性三维结构，

III.通过使多态性DNA片段与合成型PNA(肽核酸)共价连接，

IV.通过使多态性STR/SNP的片段与用SELEX方法获得的适配体结合，

V.通过DNA双螺旋的盘绕，通过使用在碱基之间以及沿所述双螺旋的嵌入分子；嵌入剂选自溴化乙锭、阿霉素、9-氨基吖啶(9AA)和原黄素(PF)(3，6-二氨基吖啶)，

VI.通过使用选自精胺、亚精胺、腐胺、Hoechst 33258、纺锤菌素、戊烷脒或类似物的药物使蛋白质沉淀或聚集到DNA的大沟和小沟，

VII.通过与磷酸盐和/或含氮碱基反应的聚集体形成，使用二价金属复合物例如Sr⁺²、Ba⁺²、Mg⁺²、Ca⁺²、Mn⁺²、Co⁺²、Ni⁺²和Cd⁺²通过破坏DNA的氢键而使双螺旋去稳定。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于在所述第VI项中，这些药物与DNA的大沟和小沟的相互作用直接与AT的量相关，因此，每部分STR或SNP的序列可获得用于标记对象之多态性片段的特征性光谱。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述第五步骤中，将吸附了DNA的所述金属纳米颗粒并入到标志物使拉曼SERS信号增加10⁶至10¹⁴倍。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于在所述第五步骤中，所述连接基团选自硅烷和烷分子或其衍生物，所述连接基团与DNA分子连接以形成聚集体，所述聚集体的特征为形成单拉曼光谱信号的分子网络。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述第六步骤中，通过超速离心浓缩并通过相转化技术微囊化多态性DNA片段；将多态性DNA溶解在溶剂中，然后选自可生物降解聚合物和非可生物降解聚合物的聚合物以0.25％至10％重量/体积的浓度也溶解在相同溶剂中。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于在所述第六步骤中，所述溶剂为选自氯仿和亚甲基氯的有机溶剂，并且非溶剂选自乙醇和己烷。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于在所述第六步骤中，所述可生物降解的聚合物选自乳酸、乙醇酸、聚酐、聚氨基甲酸酯、丁酸聚酸、戊酰聚酸或类似物。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于在所述第六步骤中，所述非可生物降解聚合物选自乙烯乙酸乙烯酯、聚丙烯酸、聚酰胺及其共聚物和混合物。